硝化细菌及其在污水脱氮中的作用.doc

环境污染与防治 网络版 第6期 2007年6月硝化细菌及其在污水脱氮中的作用张艳芬第一作者：张艳芬，女，1979年生，硕士研究生，研究方向为环境微生物学。#通讯作者。 辛明秀1# 高文臣1 赵 颖2 周 军2（1.北京师范大学生命科学学院，北京 100875；2.北京城市排水集团有限责任公司，北京 100038）摘要 主要介绍了硝化细菌（氨氧化菌、亚硝酸氧化菌）的种类以及硝化细菌细胞中参与硝化过程的关键酶。研究了影响硝化反应的影响因素如溶解氧、pH、自由氨浓度、温度和有机物，并概述了分子生态学研究方法如荧光原位杂交（FISH）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）等在硝化细菌研究中的应用。关键词 硝化细菌 硝化反应 污水脱氮 氨单加氧酶 羟氨氧化还原酶Advances on nitrifying bacteria and its application in wastewater nitrification Zhang Yanfeng1，Xin Mingxiu1，Gao Wenchen1，ZhaoYing2，Zhou Jun2. (1.Colledge of Life Science，Beijing Normal University，Beijing 100875; 2.Beijing Drain Limited-liability Company，Beijing 100038)Abstract：The advances in studying nitrifying microorganisms including ammonia oxidizers and nitrite oxidizers bacteria in wastewater treatment were reviewed in this paper. The enzymes related to nitrification in nitrifying bacteria and some factors such as pH, oxygen and ammonium concentrations which effect on the nitrification were introduced.The application of several molecular techniques such as fluorescent in situ hybridization (FISH) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) were also refered in this paper.Keywords：Nitrifying bacteria Nitrification Wastewater nitrification Ammonia monooxygenase Nitrite oxidoreductase.控制污水中的氨氮含量是污水处理中的重要内容。污水脱氮的基本原理是污水中的含氮有机物首先经过微生物的氨化作用转化为氨，硝化细菌通过硝化作用，将氨氧化为亚硝酸盐，并继续氧化为硝酸盐。硝酸盐经过反硝化细菌的反硝化作用被转化为N2等气体成分而释放到大气中，从而实现污水脱氮1。硝化作用是这一过程中的一个中间环节，也是一个重要环节。硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化为亚硝酸和硝酸的过程，由硝化细菌完成。硝化细菌是一类好氧化能自养细菌，包括亚硝化细菌和硝化细菌两个亚群。硝化细菌能够利用还原态无机氮化合物进行自养生长，硝化细菌的生命活动在污水脱氮中起重要作用。由于硝化细菌是化能自养菌，其生长速率很慢，因此硝化细菌的生命活动成为污水脱氮的关键步骤之一。因为硝化细菌在污水脱氮中的特殊意义，对这类微生物的研究受到广泛关注。1 硝化细菌的种类及其特性硝化细菌是一类好气性细菌，以氧作为末端电子的受体，利用氨被氧化为亚硝酸及亚硝化氧化为硝酸过程中所获得的能量作为同化CO2的能源。硝化细菌在自然环境中广泛存在，如在有氧的水中或砂层中都可发现硝化细菌，在氮循环及水质净化过程中扮演着很重要的角色。硝化作用是由两类细菌分两个阶段完成的。第一个阶段是氨氧化为亚硝酸，由亚硝化细菌即氨氧化细菌完成，第二阶段是由亚硝酸氧化为硝酸，由硝化细菌即亚硝酸氧化细菌完成。伯杰氏细菌鉴定手册第八版中亚硝化细菌包括亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、亚硝化球菌属（Nitrosococcus）、亚硝化叶菌属（Nitrosolobus），硝化细菌包括硝化杆菌属（Nitrobacter）、硝化刺菌属（Nitrospina）、硝化球菌属（Nitrococcus）等共十四种。伯杰氏细菌鉴定手册第九版中除上述七属外又增加了两个属，即硝化螺菌属（Nitrospira）和亚硝化弧菌属（Nitrosovibrio）共二十个种2，硝化细菌的各属特性比较见表1。表1 硝化细菌的特性及其比较1)硝化细菌菌体大小C+G%储存物细胞色素,色素pH范围温度范围Nitrosomonas0.71.5(1.02.4)47.751.0多聚磷酸+淡黄至淡红5.88.5530（2530）Nitrosocus1.51.8(1.72.5)50.551肝糖，多聚磷酸+淡黄至淡红6.08.0230Nitrosopira0.30.8(1.08.0)54.1+淡黄至淡红6.58.51530(2035）Nitrosolobus1.01.5（1.02.5）53.655.1肝糖，多聚磷酸+淡黄至淡红6.08.21530Nitrosovibrio0.30.4（1.13.0）547.57.82530Nitrobacter0.60.8（1.02.0）60.161.7肝糖，多聚磷酸和PHB+淡黄色7.58.5510Nitrospina0.30.4（2.76.5）57 5肝糖+，-7.58.02530Nitroccus1.51.8612肝糖和PHB+淡黄至淡红6.88.01530nitrospira0.30.4507.58.02530注：1）前5种为亚硝酸细菌，后4种为硝酸细菌。2 硝化作用的关键酶在整个硝化反应过程中，氨在氨单加氧酶（AMO）的催化下被氧化为羟氨，羟氨再经羟氨氧化还原酶（HAO）的催化被氧化成了亚硝酸，进而再被硝化细菌的亚硝酸盐氧化还原酶催化成硝酸。整个过程的限速步骤是亚硝化细菌进行的氨的氧化。氨单加氧酶和羟氨氧化还原酶是硝化反应过程中的关键酶。2.1 氨单加氧酶（AMO）氨单加氧酶(AMO)是亚硝化细菌中能够催化由氨转化为羟氨的酶，它是膜结合酶。该酶具有底物广谱性，可以催化氨的氧化，还可作用于其他多种底物，如脂肪烃族、芳香族和卤代族化合物在内的多种基质。氨单加氧酶的活性可被乙炔非逆转性抑制，也可被金属螯合剂抑制，而金属螯合剂能够结合多种金属，尤其是铜，这就提示氨单加氧酶可能以铜等金属离子作为其辅酶。到目前为止尚未得到纯化的AMO，它的许多性质都是通过完整的细胞试验获得的。间接的实验证明，AMO含铜。AMO具有两个亚单位AMO-A和AMO-B，Hyman等用14C培养Nitrosomonas europaea，可使14C结合至一个分子质量为27 kD的膜内多肽上。这个被标记的多肽可能是AMO的活性部位，因为它被乙炔共价修饰的程度越高则保留的氨氧化活性越低，反之当AMO的氨氧化活性完全丧失时，被14C标记的多肽也不再增多。实验证明，N.europaea能将甲烷氧化成甲醇、乙烯转化成环氧丙烷、环己烷转化为环己醇、苯转化为苯酚、CO转化为CO2，酚转化为醌。AMO除了能进行单加氧反应之外，还可以进行脱氢氧化和脱氯的反应。AMO是膜结合蛋白，它只能催化非离子氨氧化（NH3）而不能催化离子氨（NH4+）氧化，而在环境中NH4+与NH3的动态平衡中，倾向于NH4+的方向，使得NH3的浓度很低，这也是在硝化作用中氨的氧化成为限速步骤的原因。编码AMO的基因簇amo至少含有三个基因（amoA amoB和amoC），它们位于一个操纵子中，排列顺序为amoC、amoA、amoB.不同种之间的amo基因的排列相同且具有很高的序列相似性，在一个细胞中一般含有3个拷贝的amo，且不同拷贝之间具有很高的保守性（99%）3。突变研究表明amo基因的三个拷贝都是功能型的，但表达的程度不同，这些基因受氨及亚硝酸的诱导表达4。2.2 羟氨氧化还原酶（HAO）HAO已被分离纯化，在制备原生质体时，HAO即可从细胞中游离出来，表明这种酶位于外周质中。HAO仅含一种分子质量为63 kD的亚单位，每个亚单位由8个共价结合的血红素组成，其中7个为C型血红素，第8个为P460血红素。8个亚单位的氧化还原电位范围为-412 +288 mV，其中氧化还原电位较高的P460(它结合在以桥键相联的肽上)和一个C型血红素被认为是HAO的活性中心，而其他6个氧化还原电位较低的亚单位的作用尚未探明。在羟氨氧化的电子传递过程中，与HAO关系比较紧密的是细胞色素C554以及C552。HAO是由相同亚基构成的三聚体细胞周质蛋白，它可以氧化羟氨，释放出两对电子，一对直接用于氨的氧化过程，另一对用于细胞物质的合成以及ATP的产生。对hao的研究甚多，但都不是很深入。迄今而至，研究的较为详尽的是欧洲亚硝化单胞菌的hao基因，长为1 710 bp，由氨和亚硝酸诱导表达，转录为一个单顺反子的mRNA，与其他细胞周质蛋白一样，该基因也编码一个18-24氨基酸残基序列的前导肽，该前导肽在HAO的转运和成熟的过程中被切除。该菌中含有3个hao基因拷贝5，不过他们相距甚远，除了一个拷贝的一个核苷酸外，3个拷贝的编码区域的核苷酸序列完全一样，只是在它们的编码区上游的序列有些差异。在AMO和HAO的作用下，氨转变成羟氨和亚硝酸，所以在硝化反应过程中AMO和HAO是两个关键性的酶。通过对AMO和HAO的研究有望提高硝化细菌的生长速率和硝化速率。3 硝化反应的影响因素由于硝化细菌化能自养的特殊性，导致易受外界因素的影响，其影响因素主要如下：3.1 溶解氧（DO）在活性污泥硝化系统中，大多数学者认为溶解氧应控制在1.52.0 mg/L，溶解氧值偏大，一方面加剧了活性污泥的内源呼吸，造成活性污泥的大量消耗，另一方面高溶解氧对反硝化反应不利，能耗也增大，降低了设备运行的经济性。溶解氧值偏小时硝化作用将趋于停止。HANAKI研究表明，低DO下，氨氧化细菌增殖速率加快，补偿了由于缺氧造成的代谢活动下降，使得整个硝化阶段中氨氮氧化未受到明显抑制。LAANBROEK研究进一步表明在缺氧状态下，亚硝酸大量积累是由于氨氧化细菌对DO的亲和力较亚硝酸细菌强。但ECKENFELDE提出DO必须在2 mg/L以上。也有人提出DO不能低于0.5 mg/L，还有人提出对氨氧化细菌和亚硝酸细菌有所差异，DO分别为1.0、2.0 mg/L。而MICHAEL与RICHARD在总结大量文献的基础上通过对各种因素及双底物限制动力学进行分析得出结论：在较高的平均细胞停留时间的（MCRT）的条件下，DO在0.51.0 mg/L就可完成硝化作用，MCRT较低时完全硝化则需要较高的DO。而STENSTROM认为能发生硝化作用的最低DO约为0.3 mg/L。王歆朋等发现低的DO（0.8 mg/L）会对硝酸菌的生长酶系产生抑制作用，而对亚硝酸细菌的生长酶系产生促进作用。总之为了确保硝化作用有效进行，最好硝化系统中DO保持1.01.5 mg/L。3.2 pHpH是影响硝化作用的重要环境因素之一，在pH中性或微碱性条件下，硝化过程迅速，适宜的pH是7.38.5。对于亚硝酸细菌会选择此范围的上限，其最佳pH是7.88.4，这时硝化速率达到最大。当pH超越这一最佳范围时，硝化速率将降低，当pH7.0时，亚硝酸细菌生长缓慢。当pH6.5时，亚硝酸细菌的生长将受到抑制。当pH6.0时，系统中的硝化作用将会停止。而硝酸细菌的最佳pH为7.37.5。3.3 自由氨（FA）FA的升高导致亚硝酸氮的累积，这将严重抑制亚硝酸转化为硝酸。SHAHER曾报道：氨氮在510 mg/L，没有亚硝酸积累，他发现随着氨氮浓度由7.5 mg/L10 mg/L17 mg/L25 mg/L35 mg/L45 mg/L的逐渐升高过程中，亚硝酸积累呈增大趋势。AUTHONISEN在实验中注意到高浓度的FA对硝化反应有抑制作用，并影响到硝化产物。还有一些实验表明，高浓度的FA所造成的亚硝酸的积累并不稳定，时间一长系统中亚硝酸浓度和亚硝化比率均会下降，硝酸浓度增大，这说明硝酸菌对FA产生的抑制会逐渐适应。溶解氧和氨的浓度以及pH是影响硝化反应速率的重要环境因素。有国外文献报道，高浓度的氨可以选择一个新的硝化菌群，高氨引起的菌群的变化是逐渐发生的。这说明，硝化细菌能更好的适应高氨环境。尽管最初系统中的硝化细菌在高氨的环境中也是相当活跃的，但更能适应这一环境的硝化细菌逐渐成为这个系统的主体。在正常pH范围的情况下，pH的改变不会导致菌群种类发生改变，但是当pH低于6.0或高于8.5时就会引起硝化细菌种类会发生变化6。3.4 温 度温度对硝化细菌的生长和硝化速率有较大的影响。一般的硝化细菌是中温生长菌，其适宜的温度范围是2530 。温度低于25 ，硝化细菌的生长缓慢，低于10 以下时硝化细菌的生长和硝化作用明显减慢。温度高于30 时，硝化细菌的生长也减慢，高于35 ，则对硝化细菌的酶系具有破坏作用，硝化细菌的生命将受到潜在的威胁。所以在任何情况下都应注意保持硝化反应器温度的稳定性，以避免极端温度和瞬间变化的温度给硝化作用带来不良的影响。对于硝化细菌的一般培养温度建议在2530 为宜。3.5 有机物硝化细菌属于典型的自养细菌，有机物对于硝化细菌是否具有毒害作用是人们普遍争论的问题。徐亚同认为多种有机物对硝化作用有抑制作用。近来越多的研究表明，有机物对硝化细菌的影响主要是因为有机物的存在刺激异养细菌迅速生长，从而使异养细菌与硝化细菌竞争溶解氧、氨和微量营养物质，使得硝化细菌的生长受到限制，而有机物本身并不直接影响硝化细菌的生长与硝化作用。4 硝化细菌的分子生态学的研究近年来，分子生物学的快速发展为活性污泥微生物学研究提供了新的分析技术与方法，不依赖于传统的纯种分离方法就能实现对复杂的微生物群体进行菌群结构的分析和定量评估。以PCR和荧光原位杂交(FISH)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)为代表的分子生物学分析方法已得到了广泛的应用和发展。荧光原位杂交(FISH)技术是利用带有荧光标记的特异性寡核苷酸探针,与细胞内相应的靶核苷酸序列特异结合，从而检测目标微生物在环境中的分布。FISH具有细胞在测定过程中不被破坏、形状不改变、特异性强、能够真实反映自然环境下微生物的情况及分布等特点。由于FISH避免了传统培养方法进行鉴定和计数的局限性，对于硝化细菌、除磷细菌和丝状微生物等废水处理中常见的微生物种群研究非常有用。如对活性污泥中硫酸盐还原菌、丝状菌、聚磷菌、硝化菌和硝化细菌群落的组成和分布等的原位检测，为理解污水处理中氮素循环提供了重要的信息7。谢冰对城市污水厂中曝气池活性污泥菌胶团的硝化细菌进行FISH检测，结果表明氨氧化细菌比亚硝酸细菌多，它们多呈游离状态分布于活性污泥菌胶团上8。运用FISH方法，朱琳等对太湖、玄武湖和南京锁金村污水处理厂水样的活性污泥中的硝化细菌进行检测，发现氨氧化细菌的量比亚硝酸菌的量低一个数量级，说明该水体的微生物环境不利于氮的去处，需要进一步改善微生物环境来达到去污效果9。曾薇对四种短程脱氮系统的AOB和NOB的FISH定量分析结果显示，在亚硝酸盐积累率高于80后，AOB在活性污泥中所占的比例与亚硝酸盐积累率没有明显的相关性，但AOB相比于NOB已成为明显的优势菌群，或者已实现从系统中淘汰NOB10。变性梯度胶电泳（DGGE）的基本原理是在含有线性梯度DNA变形剂的聚丙烯酰胺凝胶上，各种DNA分子在达到各自变性浓度时发生部分解链，根据部分解链的双链 DNA分子在凝胶中的迁移率的差异，使不同分子大小，或分子大小相同但碱基序列不同的DNA分子分开。灵敏度很高，可将具有单个碱基差别的DNA分子分离开来。DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息并能同时分析多个样品，具有可重复和容易操作等特点，适合于研究种群的时空变化，并且可通过对切下的条带进行序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落成员。VYBIRAL等用DGGE研究地中海西部3种过滤海水部分（总的细菌种群，大于0.2 m的细菌部分和0.2 m滤液）中每一部分的细菌群落结构，结果表明0.2 m过滤性和总的细菌种群的主要区带的DGGE图案是不同的。DGGE图案中代表0.2 m过滤性细菌的片段主要是海洋细菌的饥饿形式而不是超微型细菌。序列分析切下的和克隆的DGGE轮廓中的DNA带显示0.2 m过滤性细菌的系统发育起源，主要与已知的、典型的和变形杆菌中的海洋分离菌和噬纤维菌属、黄杆菌属、拟杆菌属聚成群11。刘新春于2005年运用PCR-DGGE技术对活性污泥中微生物群落结构变化进行了鉴定，结果表明在活性污泥运行系统中，拥有大量的和变形菌属，这些菌属都是优势菌群，在污水处理过程中起着非常重要的作用12。MCCAIG等13运用PCR、DGGE、最大可能值法和序列分析方法研究活性污泥中氨氧化细菌的群落结构，表明氨含量和污染程度越高，氨氧化细菌含量越高。DGGE和16S rDNA序列分析揭示主要是亚硝化单胞菌类群的增加。运用不同的寡核苷酸探针通过FISH技术研究的结果说明在所有的水处理污泥和生物膜样品中都可以发现大量的硝化螺菌（Nitrospira）6，而硝化杆菌只在SBR的生物膜上找到14。与其他处理系统相比，SBR的亚硝酸盐含量要高许多，说明硝化杆菌较为适应高浓度的亚硝酸盐。HASTINGS等15用MPN、PCR和FISH等技术对富营养化的淡水湖的氨氧化作用进行了季节性的研究，得出夏天具有较强的硝化作用，水中的氨氧化细菌随季节有较大的变化，尤其是亚硝化螺菌的数量会增加。运用分子生物学技术检测环境样品中硝化细菌与传统检测方法相比具有快速、简便、准确的优点，在研究环境微生物方面有较好的应用前景。5 展 望硝化细菌在污水脱氮过程中具有重要的意义，加强对硝化细菌的研究对提高污水脱氮水平，不断改进污水处理工艺具有重要的参考意义。近年来，我国对硝化细菌进行了一些分子水平的研究，还需要不断深入。第一：加强对硝化作用分子生态学的研究，即综合应用现代分子生物学技术，研究硝化过程中的微生物生态结构和生态机制，为提高污水的脱氮处理效率提供理论指导。第二：加强硝化作用微生物的分子生物学研究，即在理论上阐明硝化微生物在活性污泥中的作用机制，克隆硝化过程中相关酶的基因，通过基因的改造，改善酶对氨的亲和力，提高硝化作用速度和效率，从而达到较好的污水处理效果。参考文献1 PAR L，MAGNUS L，FRED S，et al.Vertical distribution of nitrifying populations in bacterial biofilms from a full-scale nitrifying trickling filterJ.Environmental Microbiology，2006，8(11)：2036-2049.2 刘志培，刘双江.硝化作用微生物的分子生物学研究进展J.应用与环境生物学报，2004，10(4)：521-525.3 NORTON J M，ALZERRECA J J，SUWA Y，et al.Diversity of ammonia monooxygenase operon in autotrophic ammonia-oxidizing bacteriaJ.Arch Microbiol.，2002，177：139-149.4 STEIN L Y，SAYAVEDRA-SOTO L A，HOMMES N G，et al.Differential regulation of amonA and amonB gene copies in Nitrosomonas europaeaJ.FEMS Microbiol.Lett.，2000，192：163-168.5 HOMMES N G，SAYAVEDRA-SOTO L A，ARP D J.Transcript analysis of multiple copies of amo(encoding ammonia monooxygenase)and hao(encoding hydroxylamine 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