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现代工业微生物学实验技术补充讲义华南理工大学生物科学与工程学院张 毅 林晓珊华南理工大学教材供应中心2009年3月实验一 培养基的制备和灭菌（玻璃器皿的包扎）请同学们预习现代工业微生物学实验技术P124 培养基的制备和灭菌旨在学习各种培养基的制备方法，包括培养基的配制，包扎及灭菌技术。为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净。保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管、三角瓶等精心妥善包扎。这些工作看来很普通简单，如操作不当或不按规定要求去做，会导致实验的失败。因此应看作是微生物实验的基本操作。使玻璃器皿达到无菌状态叫灭菌。灭菌和消毒是二个不同含义的名词。消毒是指消灭病原菌或有害微生物，而灭菌则是杀死或消灭一定环境中的所有微生物。消毒与灭菌的方法很多，但总的可分为物理法与化学法两大类。物理法包括加热灭菌（干热灭菌与湿热灭菌），过滤灭菌、紫外线灭菌等。化学方法主要是利用有机或无机的化学药品对实验室用具和其它物体表面进行灭菌与消毒。在实验室里用得最多的加热灭菌法是高压蒸汽灭菌和干热灭菌。一般培养基和灭菌水等用高压蒸汽灭菌，而玻璃器皿常用干热灭菌。目的都是使细菌体内蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 高压蒸汽灭菌法 是在密闭的灭菌器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭水蒸汽不能逸出，增加了灭菌器内的压力，因此水的沸点随着上升，可获得比100更高的蒸汽温度。干热灭菌法 是在电热干燥箱内进行，加热调节箱内的温度达到所需温度为止，让温度保持160-170，1-2小时（或140-160，2-3小时）；切断电源，冷却至60时，才能把箱门打开，取出灭菌物品。 在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时湿热穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。一. 操作前准备1.各组所需的玻璃器皿(1) 小试管：12支（15*150mm）(2) 培养皿：12套（9cm）(3) 吸管：3支（1ml）(4) 三角瓶：2个（250ml） (5) 三角玻扒：3支2.各组包扎所需工具（1） 剪刀：1把（2） 铁丝：数支（3） 标签贴纸：1张（4） 油性笔：1支（5） 牛皮纸：各式（6） 棉绳：各式2. 所需仪器设备：(1) 高压蒸汽消毒器（杀菌锅）(8)(2) 电热鼓风烘箱(1)二. 实验内容：（一）玻璃器皿包扎1培养皿：洗净烘干后以牛皮纸密密包紧，一般以6套做一包，外面用绳子捆扎，以免散开，然后待灭菌。使用时在无菌室中才打开取出培养皿。2吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），棉花不宜露在吸管口的外面。然后分别将每支吸管尖端斜放在牛皮纸条的的近左端，与报纸约呈60角，并将右端多余的纸打一小结，不使散开，标上容量。若干支吸管扎成一束，待灭菌。使用时在无菌室中才打开。脱脂棉花是以防止菌体误吸口中，及口中的微生物吹入吸管而进入培养物中造成污染。3试管和三角瓶：试管和三角瓶都要做合适的棉花塞。棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶。棉塞的制作要求使棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，不能过紧也不能过松。过紧易挤破管口和不易塞入，过松易掉落和污染。棉花塞的长度不少于管口直径的二倍，约2/3塞进管口。若干支试管用绳扎在一起，在棉花塞部分外包裹牛皮纸，再在纸外用绳扎紧。三角瓶每个单独用牛皮纸包扎棉塞。棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管和三角瓶。4三角玻扒和玻棒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在牛皮纸条的近左端，与纸约呈45角，并将右端多余的纸打一小结。包扎好的玻璃器皿，请交到侧边实验台，老师检查登记，再灭菌。 （二）玻璃器皿灭菌（空消）分成两大组，由两位老师指导。1 培养皿、吸管和三角扒用高压蒸汽灭菌（由同学负责，对面两组共用一锅）2 试管和三角瓶用干热灭菌。（由老师负责）每组同学自行灭菌，练习消毒器的使用三 清理工作1 各组各自完成：(1) 清洁整理台面，将凳子收回台底。(2) 请各组按清单检查柜中物品，如有短缺请及时向组长汇报登记。2值日生工作： (1) 检查整理，台面，地板檫干净，垃圾袋扎好放在门口，更换新垃圾袋。(2) 为下班实验课提供必须物品。四实验报告：思考题：1 试管口、吸管口的棉花塞和三角瓶口的纱布有什么作用？覆盖的防潮纸又是什么作用？2 进行高压蒸汽灭菌操作应注意哪些事项？可能导致灭菌不完全的因素有哪些？3 干热灭菌完毕后，在什么情况下才可开箱取物？为什么？4 进行干热灭菌操作应注意哪些事项？为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度更高，时间更长？5 培养基和液体试剂能否进行干热灭菌？为什么？实验二 培养基的制备和灭菌（培养基的配置）请同学们预习现代工业微生物学实验技术P7981 本实验旨在学习各种培养基的制备方法，其中包括培养基的配制，包扎及灭菌技术。培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内才能表现它们最大生命力，因此不同种类的微生物应将培养基调到一定pH值范围。培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。按其组成可分合成培养基和天然培养基。按其物理状态可分固体培养基，液体培养基和半固体培养基。按其特殊用途可分加富培养基，选择培养基、鉴别培养基。 培养基配制后还必须进行灭菌。一. 操作前准备1.各组所需的玻璃器皿（1）小试管：12支（15*150mm）（2）三角瓶：2个（250ml）2.各组同学从自己木柜取出配备培养基的工具（1）烧杯：1套（50ml，100ml，250ml）（2）量筒：1个（100ml）（3）玻棒：1支（4）分液漏斗：1套（止水夹、胶管、玻璃管）（5）药匙：2把（6）剪刀：1把（7） 标签贴纸：1张（8） 铅笔：1支（9） 10mL吸管：1支（10） 调pH酸碱液：1套（11） pH试纸：1包3仪器设备：（1）电炉（8）（2）电子天平（8）(3 )手提式蒸汽消毒器（8）(4 )酸度计（8）二. 培养基的配备（实验前请先贴好标签） 各组同学先将试管和三角瓶贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置：注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。 操作步骤： 试管（在烧杯中融化琼脂）包扎称量 溶化 定容调PH过滤分装 三角瓶（内加琼脂，不加热！）包扎小烧杯 小烧杯 量筒 大烧杯 省略培养基配方：A. 肉汤培养基：营养肉汁3g 自来水150ml PH7.2B. 麦芽汁培养基：麦芽汁15g 自来水150ml 自然PH 斜面固体培养基：由液体培养基加2琼脂1. 配制肉汤培养基150ml 将小烧杯置天平上，用药匙取营养肉汤干燥培养基，称取3g加少量自来水溶解再转移到量筒定容，先配成液体培养基，再按下面方法分装：（1）取100ml装入250ml三角瓶，加入琼脂2g，浸泡于液体培养基里，用棉塞塞好瓶口，贴好标签，再用防潮纸和棉绳将棉塞罩住扎好。（2）取50ml倒在250ml烧杯里，加入琼脂1g，浸泡于液体培养基里，在电炉上加热融化后，注意补充水分保持体积不变用分液漏斗分装6支小试管，每支5ml左右（约试管高度的1/41/5左右）， 用硅胶塞塞好试管口，贴好标签，再用防潮纸和棉绳将试管塞罩住扎成一捆。2.配制麦芽汁培养基（方法同上）（二）培养基灭菌培养基分装好后，塞上棉塞，外面再用一牛皮纸包扎好，便可灭菌。灭菌的时间和温度按各培养基规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。肉汤培养基在121灭菌15分钟；麦芽汁培养基在115灭菌20分钟。培养基经灭菌后，可放在37恒温箱培养2448小时，无菌者方可使用。配制好的培养基交侧边台，老师登记，同学自行灭菌摆斜面！（三）摆斜面将灭菌的试管培养基冷至50左右（以防斜面上冷凝水太多），将使馆试管口端搁在10ML吸管（或玻棒）或其他适合高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。操作注意事项：（1）本实验使用调配好的“干燥培养基”，这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法，真空干燥法，低温干燥法或蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉；或将培养基内的各种固形成分，经适当处理，充分混匀，便成干燥粉末而成。使用时只要按比例加入一定量的水，经溶解，调pH，分装，高压蒸汽灭菌，即可使用。（2）“干燥培养基”成品很容易吸潮，在称量是动作要迅速,及时盖好盖子。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再取另一种药品。瓶盖也不要盖错。（3）在烧杯融化琼脂的过程中，人要在电炉旁看着，以免培养基因沸腾而溢出烧杯。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。注意带上棉纱手套防止烫伤。（4）分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。三. 清理工作1. 各组同学各自完成：（1）配备培养基的所有玻璃器皿必须用铁丝（或刷子）沾洗衣粉擦洗干净；洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠，清洁好的物品放回原处。（2）琼脂、标签纸等堵塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在垃圾袋里。(3) 清洁整理台面，将凳子收回台底。(4) 上次实验报告交上。2. 值日生工作： (1)检查整理台面，地板檫干净，清洁洗手盆，更换垃圾袋，丢垃圾。(2)为下班实验课提供必须物品。四. 实验报告思考题：1 培养基应具备哪些条件?2 在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题，为什么？3 培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?4 培养细菌、放线菌、酵母菌和霉菌通常可分别采用什么培养基培养？上述四大类微生 物生长繁殖的最适PH值一般各为多少？实验三 微生物的接种技术请同学们预习现代工业微生物学实验技术P8793 本实验旨在训练微生物接种的基本技能，更重要的是要初步建立无菌操作的概念。 接种技术是微生物学实验及研究中的一项最基本的操作技术。接种是将纯种微生物在无菌操作条件下移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。为了获得微生物的纯种培养（指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代），要求接种过程中必须严格进行无菌操作，一般是在无菌室内，超净工作台火焰旁或实验室火焰旁进行。根据不同的实验目的及培养方式可以采用不同的接种工具和接种方法。常用的工具有接种环、接种针、接种铲、玻璃涂棒，移液管及滴管等。常用的方法有斜面接种，液体接种，穿刺接种和平板接种，这些方法在后面的实验一一进行训练。一 操作前准备工作：1各组所需的物品（1） 接种用具：接种环（针、钩），酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，废物杯，一次性口罩，纸巾。（2） 菌种：细菌、酵母菌和霉菌（由老师提供）（3） 斜面培养基：肉汤培养基（6支），麦芽汁培养基（6支）2所需仪器设备：电热恒温培养箱(2)3注意事项：（1） 酒精不足的酒精灯请到侧边台面自行添加！注意：添加量不得超过容量的2/3。（2） 消毒棉球到讲台自行添加！没气的打火机请告知老师更换！（3） 将所有空白斜面贴好标签,注明接入菌种的名称,接种班别，接种组别，接种日期。（4） 接种前请将台面用抹布清洁，擦干；双手用洗手液清洁，擦干。（5） 斜面接种，分清菌台和培养基，挑取少量菌种，切勿划破培养基。（6） 接种时要关闭门窗，风扇，人不要随意走动，端坐，平缓呼吸。（7） 不同的菌种，不同的接种方式，使用不同的接种工具（针，钩，环，吸管）。二.实验内容：1微生物的斜面接种技术：从已长好微生物的菌种管中挑取少许菌苔接种至空白斜面培养基上的过程。斜面接种的操作方法： （1） 操作前，先用75%酒精擦手，作表面消毒，待酒精挥发后才能点燃酒精灯。（2） 用斜面接种时，将菌种管和斜面管握在左手的大拇指和其他四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处在水平位置。（3） 先将菌种管和斜面管的试管塞旋转一下，以便接种时便于拔出。（4） 右手拿接种环，拿的方式与普通日常拿笔一样。将要伸入试管部分的金属柄和金属丝在酒精灯火焰上灼烧灭菌。（5） 用右手小指、无名指或手掌将菌种管和斜面管的试管塞同时拔出，并把塞子握住，不得任意放在桌上或与其他物品接触，再以火焰烧管口。（6） 将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管内，使接种环在接种菌种前先在试管内壁上或空白培养基接触一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种然后用接种环在菌落上轻轻地接触，刮取少许后将接种环自菌种管内抽出。抽出时勿与管壁相碰，也勿使再通过火焰。（7） 迅速将沾有菌种的接种环伸入斜面试管中，在斜面上，自下而上划线，使菌种沾附在培养基上，划线时勿用力，否则会使培养基表面划破。（8） 接种完毕后将接种环抽出，灼烧管口，塞上试管塞。塞试管塞时勿要用试管口去迎试管塞，以免试管在移动时侵入杂菌。（9） 接种环在放回原位前，要经火焰灼烧灭菌。同时须将试管塞进一步塞紧以免脱落。接种菌名及接种划线方式、接种工具：细菌：枯草杆菌，大肠杆菌，单球菌（3支）（接种方式：“之”字划线，接种工具：接种环）霉菌：黑曲霉，黄曲霉，根霉（3支）（接种方式：点植或划直线，接种工具：接种钩或接种环）酵母菌：面包酵母菌，古巴酵母菌，假丝酵母菌（3支）（接种方式：划直线，接种工具：接种环）2生物的培养技术：培养箱恒温培养法将接种好的斜面试管置最适合该菌种生长温度的恒温培养箱里。(1) 一般细菌于37恒温培养箱培养1-2d (2) 一般霉菌和酵母菌于32恒温培养箱培养2-3d三清理工作1. 各组自己完成：（1） 清洗用过的玻璃器皿。要求用铁丝（或刷子）沾洗衣粉檫洗干净；洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠。（2） 将废物杯倒干净，口罩，用过的纸巾丢垃圾桶。（3） 清洁整理台面,凳子收回台底下。（4） 交实验报告。2. 值日生工作： (1)检查整理台面，地板檫干净，清洁洗手盆，更换垃圾袋，丢垃圾。(2)为下班实验课提供必须物品。四实验报告1观察记录实验结果：微生物琼脂斜面上的生长状况，是否有杂菌出现。 2思考题:（1）接种环(针)接种前后灼烧的目的是什么?为什么在接种前一定要将其冷却？（2）斜面接种的过程应注意些什么？你是否得到纯培养斜面？ （完）实验四 微生物的分离纯化技术请同学们预习现代工业微生物学实验技术P9399自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。微生物的分离、纯化技术是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。微生物的平板分离纯化技术自1880年被发明以来以有100多年的历史，该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动物细胞培养等方面的应用作出了巨大的贡献。平板稀释涂布、平板稀释混合、平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。分离纯化技术其实是进行平板接种，即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上，然后培养。平板接种的目的是观察菌落形态，分离纯化菌种，活菌计数及在平板上进行各种实验时采用的一种接种方法。本实验是利用分离纯化技术来获得三大类微生物的平板纯培养物，为下次实验微生物的形态观察提供菌落形态观察的部分（形态观察主要包括群体形态（菌落形态）和个体形态观察两个方面）。一操作前的准备工作1 各组所需物品：（1）无菌培养皿：两包，12套(2 ) 无菌三角玻扒：3支(3 ) 接种器具：酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，圆珠笔，一次性口罩，纸巾。（4） 制平板的培养基：肉汤琼脂培养基（1瓶）, 麦芽汁琼脂培养基（1瓶） (先于杀菌锅里融化)2 所需仪器设备：(1) 电热恒温培养箱（2）(2) 杀菌锅（2）(3) 水浴锅（4） 二实验内容：1平板的制备：（每组制平板12个，肉汤6个，麦芽汁6个）(5) 将融化的琼脂培养基,冷却至50左右(以手背能忍受的温度为准)。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于45时，培养基易于凝固而无法制作平板。(6) 平板的制作应在酒精灯火焰旁进行，右手掌心握住三角瓶的底部，左手打开三角瓶棉塞，以右手的无名指和末指夹持瓶塞，灼烧瓶口。左手拿培养皿，用左手的大拇子将皿盖掀开一缝，至瓶口刚好伸入，向皿内注入培养基（约15ml,厚度约0.5ml左右），迅速盖好皿盖。(7) 左手持培养皿稍加旋转摇动，使培养基均匀分布于整个培养皿底部，然后平置于桌面水平位置,待凝后即为平板。2平板分离技术注：任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿贴上标签，注明实验内容，班别，组别，日期。本实验内容包括菌种名称，分离方法。（1）平板混合分离法：（在实验九进行训练） 将菌液分离样品摇匀，用无菌移液管取1 ml的菌液移至无菌培养皿中，然后将融化，凉至50左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15 ml，摇匀，凝固，制成平板。（2）平板划线分离法（3皿）：大肠杆菌，枯草杆菌，单球菌将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙（约30）伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线,划线时平板面与接种环面成30-40,以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集,充分利用平板表面积,注意勿使前后两条线重叠.划线完毕,关上皿盖.灼烧接种环,待冷却后放置接种架上.（3）平板涂布分离法(3皿)：面包酵母菌，古巴酵母菌，假丝酵母菌将菌液分离样品摇匀，将0.1ml菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置。右手拿无菌三角玻扒在平板培养基表面上,将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直来回推动,平板内边缘处可改变方向用三角玻扒再涂布几次。（4）平板点殖（3皿）：黑曲霉，黄曲霉，根霉 一般用于观察霉菌的菌落。在无菌操作下，用接种针从斜面或孢子悬液中取少许孢子，轻轻点种于平板上。3 环境中的微生物检查注：任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿贴上标签，注明实验内容，班别，组别，日期。本实验内容为检查样品来源（1） 实验室空气中的细菌检查：将一个肉汤平板放在自己实验的实验台面上，移去皿盖，使培养基表面暴露在空气中；另一个肉汤平板放在超净工作台上，移去皿盖。1小时后盖上两个皿盖。（2） 人体细菌的检查：取一个肉汤平板，移去皿盖，将未洗过的四个手指在平板表面轻轻地按一下，盖上皿盖。注意别按破培养基！4 生物的培养技术：培养箱恒温培养法(1)细菌于37恒温培养箱培养1-2d，平板倒置培养。 (2)霉菌和酵母菌于32恒温培养箱培养2-3d，平板倒置培养。三清理工作1各组自己完成（1） 清洗用过的玻璃器皿（包括三角玻扒、三角瓶、吸管）。要求用铁丝（或刷子）沾洗衣粉檫洗干净；洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠。清洁好的器皿按原数量交到侧边台面，让老师登记。（2） 琼脂不能倒在洗涤槽里,要倒在垃圾桶,以防堵塞排水管道。（3） 清洁整理台面,凳子收回台底下。（4） 交实验报告。2值日生工作： (1) 检查整理台面，地板檫干净，清洁洗手盆，更换垃圾袋，丢垃圾。(2) 为下班实验课提供必须物品。四实验报告1 观察记录实验结果：微生物的菌落特征。菌 名特 征 描 写大小形态干湿高度透明度颜色边缘1枯草杆菌2大肠杆菌3单球菌4面包酵母菌5假丝酵母菌6古巴酵母菌7黄曲霉8黑曲霉9根霉注：菌落特征描写方法参考如下：a) 大小：大，中，小，针尖状b) 形态：圆形，不规则等c) 干湿情况：干燥，湿润，粘稠d) 高度：扁平，隆起，凹下e) 透明度：透明度，半透明，不透明f) 颜色：黄色，金黄色，灰色，乳白色，红色，粉红色，黑色等g) 边缘：整齐，不整齐2思考题:（1）实验所应用的分离纯化方法是否较好地得到了单菌落？如果那种不理想，请分析原因。(2 )如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。（3）在恒温培养箱中培养微生物时为何培养皿需倒置?（4）比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？样品来源菌落数（1/4平板）菌落类型数（近似值）实验五 微生物基本形态的观察（酵母菌和霉菌菌的制片技术及形态观察）请同学们预习现代工业微生物学实验技术P2429及P5060微生物的形态观察包括个体形态观察和群体形态观察（菌落特征观察）。微生物的个体形态都很小，必须借助显微镜，如相差显微镜，电子显微镜，光学显微镜才能看清。一般实验室常用普通光学显微镜。酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，大多数以出芽方式进行无性繁殖，本实验通过美蓝染液水浸片来观察酵母的形态。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。霉菌的菌丝体及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。观察霉菌的形态有多种方法，本实验让同学练习直接制片观察法，再介绍载片培养观察法。直接制片法是将培养物置于乳酸石炭酸液中，制成霉菌制片镜检。制成的霉菌制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保持较长时间；能防止孢子飞散。载片培养方法是用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。一 实验前准备1 菌种：酵母菌，霉菌各3种，由上次实验提供（同学们自制的平板）2 每组制片用具：接种工具1套，载玻片9片，盖玻片6片，玻片架3个，吸水纸（或纸巾），一次性口罩，一次性手套，保鲜袋。3 染液：乳酸石炭酸，美蓝。4 所需仪器设备：显微镜（32） 二 实验内容：（每组完成）1 观察上次实验结果记录：细菌、酵母菌、霉菌的菌落特征。2 显微镜的构造，性能和使用方法。3 酵母菌,霉菌的制片技术及个体形态观察：（戴上一次性口罩）（1）美蓝浸片（各1片）：（面包酵母菌、古巴酵母菌和假丝酵母菌）操作步骤：a.用镊子夹取干净载玻片一块于酒精灯焰上烧干净，除去油类等有机物质，平放在载玻片架上冷却。b.在载玻片中央加一滴美蓝染液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。c.用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。d.将制片放置约3分钟后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。( 2 )乳酸石炭酸浸片（各1片）：（根霉、黄曲霉和黑曲霉）操作步骤：a.用镊子夹取干净载玻片一块于酒精灯焰上烧干净，除去油类等有机物质，平放在载玻片架上冷却。b.在载玻片上加一滴乳酸石碳酸，用灭菌接种针挑取少量菌丝体置载玻片上的染液中（可用另一接种针辅助将菌丝体抹下），并尽量保持原状。c.盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态；加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。（3）用显微镜直接观察培养皿菌落。（4）镜检绘图。酵母菌：观察其细胞形状；无性繁殖是芽殖或裂殖，芽体在母体细胞上的位置，有无假菌丝等特征；有性繁殖形成的子囊和子囊孢子的形状及数目。曲霉：观察菌丝体有无横隔、足细胞，注意分生孢子梗、顶囊、小梗及分生孢子着生状况及形状。根霉：观察无隔菌丝（注意菌丝内常有气泡，不是横隔）、假根、匍匐根、孢子囊梗、孢子囊及孢囊孢子。孢囊破裂后能观察到囊托及囊轴。（5）载片培养技术（演示）三 清理工作：1各组完成（1）载玻片清洁方法：再用海绵块粘洗衣粉檫洗干净,过水,然后放在洗涤液中浸泡,待再次冲洗。（2）清洗有培养物的培养皿方法：将带培养物的培养皿，放到沸水锅中消毒后，再用铁丝球沾洗衣粉擦洗，过水。（3）清洁整理台面,收拾桌子。（4）交实验报告。2 值日生工作： （1）检查整理台面，地板檫干净，清洁洗手盆，更换垃圾袋，丢垃圾。（2）为下班实验课提供必须物品。四 实验报告：1 绘图说明你所观察到酵母菌，霉菌的个体形态特征。（共6个）绘图示例：以一个圆圈代表一个视野，要注名菌名和放大倍数。菌种名称：啤酒酵母放大倍数：10402思考题：（1）你认为影响名视野显微镜分辨率的因素有哪些？（2）如何根据所观察四大类微生物大小的不同，选择不同的物镜进行有效的观察？（3）酵母进行有性繁殖形成子囊孢子与什么条件有关？（4）美蓝染色液浓度和作用时间与酵母死、活细胞比例变化是否有关系？为什么？（5）根霉和曲霉在个体形态特征上有何区别？（完）实验六 微生物基本形态的观察（细菌和放线菌的制片技术及形态观察）请同学们预习现代工业微生物学实验技术P2429及P6073微生物的形态观察包括个体形态观察和群体形态观察（菌落特征观察）。微生物的个体形态都很小，必须借助显微镜，如相差显微镜，电子显微镜，光学显微镜才能看清。一般实验室常用普通光学显微镜。细菌细胞小而透明，如果菌体和背景没有较大的明暗度差别，是很难看清它们的形态的，更不易于识别其结构，所以，观察细菌时，往往要将细菌进行染色，借助颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构。因此，微生物的染色及形态结果的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。微生物细胞染色的的基本原理是根据物理因素和化学因素的作用。物理因素包括细胞及细胞质对染料的毛细现象、渗透、吸附、吸收作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生的化学反应。一般酸性成分对碱性染料较易吸附，而且较稳定。同样，碱性成分对酸性染料也较易吸附，而且也较稳定。一、实验前准备1菌种：细菌3种，老师提供标准菌种。2每组制片用具：接种工具1套，载玻片9片，玻片架3个，吸水纸（或纸巾），一次性口罩，一次性手套，保鲜袋。3染色剂1套：革兰氏A、B液，蕃红花红（沙黄），乙醇，无菌水，二甲苯，冲洗蒸馏水1瓶4所需仪器设备：（1）吹风筒（16）（2）显微镜（32）二、实验内容：（每组完成）1、显微镜的构造，性能和使用方法。2、细菌的制片技术及个体形态观察：（戴上一次性口罩）（1）简单染色（单球菌）操作步骤：a.烧片：用镊子夹取浸于酒精中的干净载玻片一块，于酒精等焰上烧去油脂及其他有机物，平放于载片架上冷却。b.涂片：取载玻片，滴一小滴无菌水于玻片中央，用接种环以无菌操作从平板上挑取 少许菌苔于水滴中，混均并涂成薄膜。载玻片要洁净，滴无菌水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不宜过厚。c.固定：自然干燥后，将涂片面朝上，在火焰上通过3-4次。此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。注意热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。d.染色：将玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜），草酸铵结晶紫染色（革兰氏A液）约1分钟。e.水洗：斜置玻片，倒去染液，用蒸馏水冲洗，直至涂片上流下是水无色为止。水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜脱落。f.干燥：自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。g.镜检：涂片干燥后镜检。涂片必须干燥后才能用油镜观察。（2）革兰氏染色法（枯草杆菌，大肠杆菌）操作步骤：a.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。涂片不宜太厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）b.初染：滴加草酸铵结晶紫（革兰氏A液）（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2分钟，水洗。c.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟（此时结晶紫与碘液成复合物），水洗。d.脱色：用吸水纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。脱色时间一般约为20-30秒。e.复染：用蕃红花红复染约2分钟，水洗。f.干燥：自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。g.镜检：干燥后，用油镜观察。三 清理工作：1各组自己完成（1）镜检后物镜头的清洁：先用镜头纸加二甲苯去油，再用镜头纸将残留二甲苯去尽。（2）载玻片清洁方法：再用海绵块粘洗衣粉檫洗干净,过水,然后放在洗涤液中浸泡,待再次冲洗。（3）清洗有培养物的培养皿方法：将带培养物的培养皿，放到沸水锅中消毒后，再用铁丝球沾洗衣粉擦洗，过水。（4）清洁整理台面,收拾桌子。（5）交实验报告。2 值日生工作： （1）检查整理台面，地板檫干净，清洁洗手盆，更换垃圾袋，丢垃圾。（2）为下班实验课提供必须物品。四实验报告：1绘图说明你所观察到的细菌和放线菌个体形态特征。（共6个）绘图示例：以一个圆圈代表一个视野，注名菌名和放大倍数。 枯草杆菌G+放大倍数：10100 2思考题：(1) 在进行细菌涂片和加热固定时，应注意哪些环节？（2）影响革兰氏染色的结果主要有哪些因素？最关键的是哪一步操作？为什么？（3）对细菌进行单染色时，染色时间对染色效果有何影响？为什么？（4）用油镜观察的细菌染色标本片，为什么要求其表面完全干燥？实验七 微生物生长,数量及大小的检测请同学们预习现代工业微生物学实验技术P123133微生物个体生长的时间较短，很快进入分裂繁殖阶段，个体生长难以测定。它们的生长一般以繁殖即群体生长作为微生物生长的指标。群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定数目的方法有显微镜直接计数法、平板计数法、光电比浊法等。显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具即测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。一操作前的准备工作1各组所需物品：（1）血球计数板（1个）（2）显微测微尺（1套）（3）菌液（4）接种器具：镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，铅笔，纸巾，滴管。（5）培养基制备器具：1套2所需仪器设备：（1） 吹风筒（16）（2） 显微镜（32）（3） 杀菌锅（8）二实验内容：1 酵母菌数量的检测(1) 显微镜直接计数法（每人1片）注意事项：A.取样时先要摇匀菌液;加样时计数室不可有气泡产生。 B.调节显微镜光线的强弱适当。(2) 平板菌落计数法 (实验八)2 酵母菌大小的检测注意事项：观察时光线不宜过强,否则难以找到镜台测微尺的刻度;换高倍镜和油镜校正时,务必十分小心,防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。（1）测微尺的校正（标定）： 两重合线间镜台测微尺格数10m目镜测微尺每格长度(m)= 两重合线间目镜测微尺格数（2）酵母菌大小的测定：利用制好的血球器浸片，用高倍镜测出宽和长各占目镜测微尺的格数，再将测到的格数乘以目镜测微尺（用高倍镜时标定的）每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。三准备下次实验的培养基和玻璃器皿（每班）由值日的同学负责1 淀粉平板培养：6瓶，100ml/瓶（肉汤培养基+可溶性淀粉1）2 明胶液化培养基：40支，5ml/支（肉汤培养基+明胶12%-18%）3 糖类发酵培养基(加杜氏小管)：80支，5ml/支4 蛋白胨水：40支，5ml/支5 培养皿：36皿，包成6包，6皿/包四清理工作1 各组清洁工作：（1） 清洁用过的血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物冲刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每一格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。（2） 清洁整理台面,收拾桌子。（3） 交实验报告。2值日生工作： (1)检查整理台面，地板檫干净，清洁洗手盆，更换垃圾袋，丢垃圾。(2)为下班实验课提供必须物品。五实验报告1. 结果记录：(1)将计数结果记录下表。A表示五个中方格中的总菌数。B稀释倍数为102。 各中格中菌数AB二室平均值菌数/ml12345第一室第二室注:1ml菌液总数=A/525104B=5106A（2）将目镜测微尺校正结果填入下表:接物镜接物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的平均长度/m低倍镜高倍镜注：目镜放大倍数：10(3)将酵母菌大小测定结果填入下表：菌名目镜测微尺每格代表的平均长度/m宽长菌体大小范围/m目镜测微尺格数宽度/m目镜测微尺格数长度/m面包酵母菌2.思考题：(1) 更换不同放大倍数的目镜或物镜时，为什么必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行标定？(2) 在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？ (完)实验八 微生物的生理生化反应请同学们预习现代工业微生物学实验技术P159169 微生物代谢与其他生物代谢有着许多相似之处，也有不同之处。微生物代谢重要特征之一，就是代谢类型的多样性，因此使得微生物在自然界的物质循环中起着重要的作用，同时也为人类开发利用微生物资源提供更多的机会与途径。人们在微生物的分类鉴定工作中，常利用其生理生化反应作用作为重要依据。 本实验分别安排微生物对生物大分子的分解利用（淀粉水解实验水解试验、明胶液化试验），对含碳化合物的分解利用（糖发酵试验）以及对含氮化化合物的分解利用（吲哚试验），让同学们对微生物的代谢类型多样性有一个初步和感性的了解，同时学习利用微生物形态、结构以及生化反应的特征对某些细菌进行初步的分类。 本实验进一步学习平板接种法、穿刺接种法、液体接种法。一 实验前准备：1培养基：（1） 淀粉水解培养基：2皿；（2） 明胶液化培养基：2支（3） 糖类发酵培养基：4支（4） 蛋白胨水培养基：2支2 接种用具：接种环（针、钩），酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，废物杯，一次性口罩，纸巾，油性笔。3 实验菌种：枯草杆菌、大肠杆菌4 配置培养基的工具：1套5 所需仪器设备：（1） 电子天平（8）（2） 电热恒温培养箱（2）（3） 杀菌锅（8）二 实验内容：试验名称培养基名称接种菌名称接种方式每组种数淀粉水解试验淀粉水解培养基枯草杆菌和大肠杆菌平板点殖2明胶液化试验明胶液化培养基大肠杆菌和枯草杆菌穿刺2糖类发酵试验糖类发酵培养基大肠杆菌和枯草杆菌液体4吲哚试验蛋白胨水培养基大肠杆菌和枯草杆菌液体2三 操作步骤：1 淀粉水解试验：（2皿）（1）翻转平板使底皿背面向上，用油性笔在其背面玻璃上画上三个圆圈。（2）用接种环在圆圈中间以点植的方式接上菌种。一皿接枯草杆菌，另一皿接大肠杆菌。（3）将接完种的平板倒置于37恒温培养箱，培养24h。（4）观察结果时，可打开皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻旋转，是碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外酶活力的高低。（以“+”、“”表示有无透明圈）2 明胶液化试验：（2支）（1）以穿刺接种法分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于明胶培养基中。（2）接种后置于20恒温培养箱，培养2-5d。（3）观察结果时，注意培养基有无液化现象。（以“+”、“”表示有无液化现象）注意：如果细菌在20时不能生长，则必须培养在所需的最适温度下，观察结果时需将试管从恒温箱里取出，置于冰浴中，才能观察液化程度。3 糖类发酵试验：（4支）（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于同种糖类培养基中，以作比较。（2）接种后置于37恒温培养箱，培养24h。（3）观察结果时，看各管颜色变化及杜氏小管有无气泡。产酸产气用“”表示；只产酸不产气用“+”表示；不产酸也不产气用“”表示。4 吲哚试验：（2支）（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于蛋白胨水培养基中。（2）接种后置于37恒温培养箱，培养24h。（3）观察结果时，在培养液中加入乙醚3-4滴（使呈明显的乙醚层）。充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚试剂2滴。如吲哚存在，则乙醚层呈玫瑰红色（注意：加入吲哚试剂后，不可再摇动，否则红色不明显）。以“+”、“”表示有无红色的玫瑰吲哚。四 为下次实验（“水和食品中微生物的检测” ）准备培养基和玻璃器皿：(1) 肉汤培养基：100ml,装在250ml三角瓶（加入1.5%琼脂）(2) 乳糖胆盐发酵培养基：100ml分装10支大试管(加杜氏发酵管)，10ml/支(3) 生理盐水：250ml，其中225ml装在500ml三角瓶(加适量玻珠);18ml分装2支大试管，9ml/支剩余的丢弃。(4) 吸管：2支10ml，5支1ml(5) 培养皿：6皿五 清洁工作1 各组清洁工作：（1） 培养基配置的工具洗净放回柜子。（2） 清洁整理台面,收拾桌子。（3） 交实验报告。2值日生工作：）(1) 检查整理台面，地板檫干净，清洁洗手盆，更换垃圾袋，丢垃圾。(2) 为下班实验课提供必须物品。六 实验报告1 细菌对各种生理生化试验反应的原理：试验名称反应物细菌分泌胞外酶水解（代谢）产物检查试剂阳性反应淀粉水解明胶液化糖类发酵吲哚试验2细菌对各种生理生化试验反应的结果：试验名称试验菌种淀粉水解试验明胶液化试验糖类发酵试验吲哚试验葡萄糖乳糖枯草杆菌大肠杆菌2 思考题（1） 微生物的糖类发酵试验、淀粉水解试验和脂肪水解试验各依据的是什么原理？（2） 如何解释淀粉酶和脂肪酶是胞外酶而不是胞内酶？（3） 若不利用碘液显色，能否证明微生物酶水解淀粉的发生？（完）实验九 水和食品中微生物的检测请同学们预习现代工业微生