免疫共沉淀结合质谱分析筛选HMGB4相互作用蛋白.pdf

2 0 1 2 瘁4 月 第3 5 卷第2 期 湖南师范大学自然科学学报 J o u r n a lo fN a t u r a lS c i e n c eo fl t a n a nN o r m a lU n i v e r s i t y V 0 3 5N o 2 A p r 2 0 1 2 免疫共沉淀结合质谱分析筛选H M G B 4 相互作用蛋白 王 成 赵晓蒙 帅勇 李晓峰 刘喜枝 张晓婷 周 湖南师范大学生命科学学院 蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室 中国长沙 摘要为揭示H M G B 4 在精子发生过程中所起的作用 采用免疫共沉淀技术富集N T e r a 2 细胞中的H M G B 4 结合蛋白 S D S 聚丙烯酰胺凝胶电泳 S D S P A G E 对免疫沉淀复合物进行分离 从胶中切取H M G B 4 结合蛋白条 带 胶内酶解后进行电喷雾串联质谱 L C E S I M S M S 分析 得到相应的肽序列标签 p e p t i d es e q u e n c et a g s P S T 通过搜索数据库在N T e r a 一2 细胞系中鉴定到5 个H M G B 4 相互作用蛋白 分别是P d h a l K e r a t i n6 B K e r a t i n5 A c t bA c t i nc y t o p l a s m i c1 R P L l 8 为进一步研究H M G B 4 在精子发生机制中的生理功能提供了基础 关键词H M G B 4 N T e r a 2 免疫共沉淀 相互作用蛋白 中图分类号Q 7 8 文献标识码A 文章编号1 0 0 0 2 5 3 7 2 0 1 2 0 2 0 0 7 1 0 5 S c r e e n i n go fH M G B 4i n t e r a c t i n gP r o t e i n sU s i n gC o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n T e c h n o l o g ya n dM a s sS p e c t r o m e t r i cA n a l y s i s W A N GC h e n g Z H A OX i a o m e n g S H U A IY o n g L IX i a o 手昭 L I UX i z h i Z H A N GX i a o t i n g Z H O UC h a n g 一 K e yL a b o r a t o r yo fP r o t e i nC h e m i s t r ya n dD e v e l o p m e n t a lB i o l o g yo fS t a t eE d u c a t i o nM i n i s t r yo fC h i n a D e p a r t m e n to fB i o c h e m i s t r ya n dM o l e c u l a rB i o l o g y C o l l e g eo fL i f eS c i e n c e H u n a nN o r m a lU n i v e r s i t y C h a n g s h a4 1 0 0 8 1 C h i n a A b s t r a c tI no r d e rt or e v e a lt h er o l eo fH M G B 4i nt h ep r o c e s so fs p e r m a t o g e n e s i s t h eb i n d i n gp r o t e i n so f H M G B 4w e r ee n r i c h e di nN T e r a 2c e l l su s i n gc o i m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a y T h ei m m u n o p r e c i p i t a t e sw e r es e p a r a t e do n1 0 S D S p o l y a c t y l a m i d eg e l t h e nt h eb i n d i n gp r o t e i n sw e r ec u tf r o mt h eg e la n da n a l y z e db yL C E C I M S M Sa f t e rt h ee n z y m o l y s i s T h ec o r r e s p o n d i n gp e p t i d es e q u e n c et a g s P S T a n di d e n t i f i e d5 i n t e r a c t i n gp r o t e i n so f H M G B 4w e r eo b t a i n e di n 出eN T e r a 一2c e l l su s i n gt h ed a t a b a g e T h e s ei n t e r a c t i n gp r o t e i n s s u c ha sP d h a l K e r a t i n 6 B K e r a t i n5 A c t bA c t i nc y t o p l a s m i c1 R P L l8 e s t a b l i s h e df o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d yo np h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n so fH M G B 4i nt h em e c h a n i s mo fs p e r m a t o g e n e s i s K e yw o r d s H M G B 4 N T e r a 一2 C O i m m u n o p r e c i p i t a t i o n i n t e r a c t i n gp r o t e i n s H M C B 4 基因是本实验室运用数字差异显示方法克隆的一个人类睾丸特异性表达新基因 属于高迁移率 族蛋白 h i g hm o b i l i t yg r o u pp r o t e i n H M G 家族的一个成员 序列分析表明 与其他3 个H M G B 家族成员 不同 H M G B 4 缺乏其家族共同具有的氨基酸性尾部 4 7 1 H M G B 4 的同源基因H m g b 4 在小鼠出生两周以后在 睾丸中就可以检测到 并持续到成年 但是在成熟的附睾精子中并没有表达 在睾丸的发育过程中 小鼠基因 H m g b 4 的表达始于粗线期精母细胞并增加直至单倍体圆形精子细胞 在精原细胞 前细线期 细线期和偶线 期精母细胞没有表达 1 收稿日期 2 0 1 1 1 0 1 4 基金项目 国家自然科学基金资助项目 8 1 0 7 1 6 9 6 湖南省研究生科研创新资助项目 C X 2 0 1 1 8 2 1 4 教育部留学回国 人员科研启动基金资助项目 2 0 1 0 6 0 9 号 长沙市科技攻关资金专项资助项目 K 1 1 0 9 0 0 6 3 1 s 共同第一作者 十通讯作者 E m a i l z h o u e h a n 9 1 9 7 2 1 2 6 C O l l l 趴畅删 万方数据 7 2 湖南师范大学自然科学学报 第3 5 卷 人H M G B 4 基因强烈 优先地在成年睾丸组织表达 N o r t h e r nb l o t 分析显示一个0 7k b 大小的H M G B 4 转 录本只在成人睾丸中表达 而其他7 个组织 脑 心 肝脏 肺脏 脾脏 肾脏 卵巢 没有检测到表达 通过原 位杂交和免疫组化分析显示H M G B 4 是一个生殖细胞特异性表达基因 在正常成年人及精原细胞瘤或隐睾 症患者的睾丸中检测到阳性信号 在唯支持细胞综合征患者的睾丸中的没有检测到任何信号 利用p L 8 G 5 L u c 转录活性报告分析系统检测发现H M G B 4 可以大幅降低P 2 1 A P 一1 的荧光素酶基因的转录 说明H M G B 4 是一个潜在的转录抑制子 H M G B 4 可能在睾丸发育和精子发生的过程中起到重要作用 本文以H M G B 4 蛋白为诱饵 用H M G B 4 抗体在睾丸来源的多潜能畸胎瘤干细胞N T e r a 2 细胞中进行免 疫共沉淀 再采用S D S 一聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对含H M G B 4 结合蛋白的复合物进行分离 然后采用液相 色谱 电喷雾串联质谱 结合数据库查询鉴定H M G B 4 结合蛋白 筛选细胞内与H M G B 4 存在相互作用的蛋 白 为进一步研究睾丸来源的畸胎瘤细胞中的H M G B 4 蛋白聚集以及在精子发生过程所起的作用奠定基础 1 材料和方法 1 1 材料 细胞株N T e r a 2 由本实验室保存 胎牛血清购于美国I n v i t r o g e n 公司 M E MA l p h a 培养基购于美国I n v i t r o g e n 公司 a n t i H M G B 4 的多克隆抗体为本实验室制备 9 1 P r o t e i nA Gb e a d s 辣根过氧化物酶偶联的羊抗 兔为美国S a n mC r u z 公司产品 p 一巯基乙醇 S D S T r i s 碱 T r i s 一饱和酚 D T I B S A d N T P 丙烯酰胺 亚甲双丙 烯酰胺 T E M E D P M S F 溴酚蓝 考马斯亮蓝为上海生工的进E 1 分装试剂 D A B 过硫酸铵购自G i b c o 公司 碳 酸氢胺 二硫苏糖醇 D r I 铁氰化钾 硫代硫酸钠 碘乙酰胺 三氟乙酸 T F A 均为S i g m a 公司产品 乙腈 A C N 为国产色谱纯 1 2 方法 1 2 1 细胞培养N T e r a 一2 细胞株培养于含体积分数为1 0 胎牛血清的M E MA l p h a 培养基 添加1 0 0m g L 青霉素和1 0 0m g L 链霉素 于3 7 体积分数为5 C O 9 0 相对湿度培养箱进行培养 生长至对数期 时进行传代 细胞达到所需数量 并为对数期时 收集细胞并计数 1 2 2 细胞全蛋白提取收对数生长期的N T e r a 2 细胞 1 0c m 皿 加2m LP B S 洗1 遍 4m g 交联剂D S P 4 0 0 血D M S O 8m LP B S I K 交联3 0r a i n P B S 洗l 遍 2 0 0t x L1m o l L T r i s c lP H7 5 终浓度2 5I x m o l L 8m LP B S 皿处理1 5m i n P B S 洗1 遍 用细胞刮子收细胞到E P 管中 5 0 0g 4o c 离心3r a i n 去上清 R I P A9 0 0 斗L 1 1 0 0 c o c k t a i l 蛋白酶抑制剂稀释到1 即9I x L I l l l 冰上裂解3 0r a i n 1 20 0 0r r a i n4q C 离心1 5m i n 去除细胞碎片 沉淀 吸取上清液即为细胞总蛋白 测蛋白浓度 1 2 3 免疫共沉淀在2 个含2m g 细胞总蛋白的抽提缓冲液中分别加入3 斗g I 斗L 免疫前兔血清 对 照 和3 嵋 1g L 3 斗L 兔抗人H M G B 4 抗体 4 转鼓4h 各加入3 0 止p r o t e i n A G 珠子 4 转鼓过夜 5 0 0g 4 离心5r a i n 去上清 保留珠子 R I P A 裂解缓冲液洗涤含免疫复合物的珠子3 次 每次5r a i n 离心 收集珠子 加3 0 L2 S D S P A G E 上样缓冲液于含p r o t e i nA G 珠子的试管中 煮沸1 0r a i n 短暂离心后取 上清用于S D S P A G E 电泳分离 1 2 4S D S P A G E 电泳与凝胶染色 体积分数为1 0 的S D S P A G E 电泳结束后 分别用考马斯亮蓝和硝 酸银试剂盒进行凝胶染色 1 2 5 蛋白质酶解根据凝胶染色结果 比较实验组和对照组的蛋白条带 从胶中切取分辨较好的蛋白质 带 置于1 5m LE p p e n d o r f 管中 对经两种染色的蛋白质带分别进行脱色 还原 烷基化 酶解 萃取和脱盐等 处理 1 2 6 质谱分析和数据库查询质谱分析在德国B r u k e r 公司的H C TU l t r a 质谱仪上进行 质谱分析前的色 谱分离在A g i l e n t l 2 0 0 上进行 流动相A 液为含0 1 体积分数 下同 H C O O H 的水溶液 B 液为含0 1 H C O O H 的A C N C 液为含0 1 H C O O H 的水溶液 流速3 斗L m i n 样品在预柱中用c 液脱盐后 分析柱用 以下梯度进行梯度洗脱 5 6 5m i nA C N 体积分数从5 上升至4 0 6 5 8 5m i nA C N 体积分数保持在 8 5 梯度洗脱完成后 重新平衡分析柱 色谱洗脱的肽片段进入质谱离子源后进行一级质谱 M S 和串级质 谱 M S M S 分析 正离子检测模式 喷嘴电压1 0P S I 氮气流速为5i x L m i n 干燥气体温度为3 0 0 毛细管 电压为40 0 0V M S 和M S M S 的转换通过仪器控制软件中的A u t o m a t e dD a t aD e p e n d e n tA c q u i s i t i o n D D A 万方数据 旦 t 竺 竺疫j o 堡竺全垦i 坌折筛选H M 竺塑 塑 I 堡1 7 3 摸 1 I 控制满址设定条件的 级离子进 j 水级分析 整个质i 浮系统控制和原始数据采集山E s q u i r eC o n t r o l T M 6O 软H 完成原始质阱数据I hD a t aA n a l y s i s 软件处理成n 一格式的文件将这些文件输人数据库I P l 3 2 8 版本加I 村I 血的反转序列数据怍 使用M a s c o t 软件 M a t r i xS c j e n c eL t d U K I 的串缴质i 数据搜 索功能 M S M SI o n sS e a r c h 进行搜索 2 结果 2 1 免疫共沉淀所得蛋白质的S D S P A G E 分析 抗H M I M 抗体 j 人畸胎瘤细胞N T e r a 一2 细胞总蛋I i I 进i i 免疫共沉淀 收集的免疫共移C 淀蛋白复合物进 行S D S P A G E 分离 绛学t 5 斯亮蓝染色和1 i i l I 酸银染色后绡艇如l 冬ll 所爪与对照组相比 检测到5 条差异条 带 这些差片条带 1 t n f 能是H M G B 4 结合蛋一条 其柏刈分子质扯分刷为1 80 0 0 4 00 0 0 3 50 0 0 3 00 0 0 1 80 0 0 左右 1 鼍圣三 l A 嘲为亏 5 坤I 琵监驰也坫 Hl 为矾艟锻染也结果M e r k c r 为蚩n 分于质I I I 标准 吲为 e n t e sS M 0 4 3 I H 嗍为h m 忡I 孙 4 M U 6 7 1 o m m l 为鲍癌时匏血浒慨的绝畦 C 垃产物作为时j c 帅 H M G B 4 为 I M t I 多扰怕的匏痤机喊产物 箭儿冉州后 兼带 图1 用H M G R 4 抗体对M h 仝蛋白进行免疽其沉淀的州l I A G E 考染 和银采 I 图谱 2 2 质谱分析 从S D S P A G E 电泳凝胶t I 分别切取图l 中有差异的5 条蛋向质条带 经过脱色 还原 烷基化 酶解 萃 取等处理 制备好的样 锅使川德 司B r u k e r 公 d 的H C TU l t r a 质谱仪进行质渚分析 图2 为差异蛋n 的H U T U l t r a M S 质谱图 图中横坐怀为打分的阈值 I 判彬部分外的表小得分高H 剧值的及呵信篮白 阴影部分以内 的表示得分在阈值以F 的及小n r 信蛋白 此次获得n 0 质谱数据以得分为5 0 分以L 的作为可信蛋门 2 3 数据库搜索结果 获得的娘始质谱数据山n 抓 A n a l y s i s 软件处理成m l f 格式的文件 将这蝗文件输人数槲库l P I 3 2 8 版 本加上牛I i 成的反转序列数据库 使 t lM a s c o t 软件 M a t r i xS c i e n c eL t d U K 中的中级质曙数据搜索功能 M S M S I o n sS e a r c h 进 f 搜索鉴定 分析得到5 个与H M G I M 相互作用的蛋白 表I 分别是P d h a l K e r a t i n 6 B K e r a t i n5 A e t bA c t i nC y t o p l a s m i clR P l 1 8 表1H M G B 4 免疽共沉淀产物质谱鉴定的有效相互作用蛋白质 lP I P r o l e l nt l a l n cM WS c o r e P e p t i d e u m l r I P l 0 0 3 1 1 2 3 6 P y 4 d h I 肾 8 卵E I 一n P 洲h u m 8 1 5 8 址i c 3 I4 0 0J 4 83 6 f o r m m i t P d h a l P l O O l 3 1 3 6 6K r t 6 bK e m t i n 1 y p e1 Ic v I n s h l e t s 6 B6 02 8 58 88 P 1 0 0 1 3 9 3 0 I K 晒K e r a t i n t y p e1 1e y t o s k c J c t a l5 6 17 2 98 88 P 1 0 0 11 0 5 5 0A c l bA c t l n e y t o p l a 5 m i rI 4 17 1 07 5l l i P l 0 0 1 3 7 7 8 7 R p l 86 0 Sn b 0 洲a In t e l 1 82 80 0 76 68 矿 一 鼍 万方数据 3 讨论 湖南m I I 范大学f j 然科学学报 L L o N 黑 圳 挈 o Hh l I I X B I I kl IL P t o h t b i l i l 器 7 5 H M C o l M t m 3 D f t 5 010 I l1 5 0 I l H h i l i l yH M o w R w E 圈2 差异蛋白的H C TL n m M S 质谱图 第3 5 壮 H M G B 4 足一个生殖细胞特异f J 表达的肇凶 在正常成年人及精原细胞 搿或隐挈症患者的挈丸中都能检 测到聊I 性信号 它n 擎丸中和哪些蛋n 辩i 可们 用 是研究氕功能的重坚途径 本文应用免疫共沉淀 j 质谱分 析丰H 结合的方法 从生殖细胞起源的人畸腑掰细胞N T e m 2 细胞中鉴定厂5 个I I M C B 4 结合蛋白 分别是 P d h a l K e r a t i n6 B K e r a t i n5 A c t hA c t i C y t o p l a s m i cl R P L l 8 签定的5 个蛋I I 足史献巾未见报道的新 H M G B 4 结合蛋h 在这5 个蛋广1 1 i 酮酸脱氢酶E l a 亚单位 P D H A I 蛋白相对其他4 个篮F I 被研究报道较多 其结构 功能等都有很多相戈报道P D H A I 属于丙酮酸脱氢酶系中的成员 它位丁x 染色体短臂 含有保守的硫 辛酸焦磷酸盐结合区 丙酮欣脱氰酶系是一种催化丙酮酸脱羧反应的多酶复合体 山丙酮酸脱氧酶 二氖硫 辛酸转乙酰基酶 二氰硫辛酸脱氖酶和6 种辅助闪于 焦磷酸硫胺索 硫辛酸 F A D N A D C o A 和M g 离子 组成 丙酮酸脱氢酶复合物位于线粒体基质巾 I 是连接楷酵解和i 羧酸循环的枢纽 催化丙酮酸不可 逆地转化成乙酰辅酶A J p 把糖酵解 i 羧酸循环以及A I P 的啦成紧密地联系在一起这一蕈要反应对于 需要大 L A T P 的组织 如大脑 肌肉 来说至j 乏蕾螫目前的研究表明 P D H A I 牲因缺陷可导致丙酮酸脱氯 酶复合物活性F 降 丙酮酸代谢障碍 0 l 起乳酸酸中毒 神经肌肉损害等一系列复杂的临床表脱 川 托颦 丸来源的N T e m 2 细胞中 t l M G I 弭可以和P D H A I 结合 但H M G B 4o J P D H A l 萆凼的相互作用方式及其生理 功能 目前还小清楚 这也是作者下一步的 个研究蕈点 本文首次在皋丸来源的畸胎滴细胞巾鉴定了5 个H M G B 4 蛋n 它们和H M G I 相互作用的牛物学意义 仍然须做j i 入的探索和实验验证 但为蒯明在睾丸中H M G l M 蛋n 聚集及舛 理功能的研究提供了新的线索 参考文献 V Y D R An M A I U S E C K AE J A R Z A BM a 自目T m l o c 归 c i f i ec x p n x i o no fc o n s l i l u t l v e J ya c t i v eh e a ts h o c kf a c t o r 万方数据 第2 期 王 成等 免疫共沉淀结合质谱分析筛选H M G B 4 相互作用蛋白 1 0 1 1 1 2 1 33 1 4 1 5 1 6 i n d u c e sH S P 7 0 i r e s i s t a n ta p o p t o s i si nm a l eg e r mc e l l s J C e l lD e a t hD i f f e r 2 0 0 5 1 3 2 2 1 2 2 2 2 D EY O U N GMP D A M A N I AH S C H E U R L ED e ta 1 B i o i t f f o r m a t i c s b a s e dd i s c o v e r yo fan o v e lf a c t o rw i t ha p p a r e n ts p e c i f i e i t yt oc o l o nc a n c e r J I nV i v o 2 0 0 2 1 6 4 2 3 9 2 4 8 G O O D W I NGH S A N D E R SC J O H N SEW An e wg r o u po fc h r o m a t i n a s s o c i a t e dp r o t e i n sw i t ha h i g hc o n t e n to fa c i d i ca n d b a s i ca m i n oa c i d s J E u rJB i o c h e m 1 9 7 3 3 8 1 1 4 1 9 B U S T I NM R e v i s e dn o m e n c l a t u r ef o rh i g hm o b i l i t yg r o u p H M G c h r o m o s o m a lp r o t e i n s J T r e n d sB i c e h e mS c i 2 0 0 1 2 6 3 1 5 2 1 5 3 B I A N C H IM E A G R E S T IA H M Gp r o t e i n s d y n a m i cp l a y e r si ng o n er e g u l a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n J C u r tO p i nG e n e tD e v 2 0 0 5 1 5 5 4 9 6 5 0 6 L A N D S M A ND B U S T I NM As i g n a t u r ef o rt h eH M G 一1b o xD N A b i n d i n gp r o t e i n s J B i o e s s a y s 1 9 9 3 1 5 8 5 3 9 5 4 6 S T O T FK T A N GGS L E EKB e ta 1 S t r u c t u r eo fa c o m p l e xo ft a n d e mH M G b o x c sa n dD N A J JM o lB i o l 2 0 0 6 3 6 0 1 9 0 1 0 4 C A T E N AR E S C O F F I E RE C A R O NC e ta 1 H M C B 4 an o v e lm e m b e ro ft h eH M G Bf a m i l y i sp r e f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di n t h em o u s et e s t i sa n dl o c a l i z e st ot h eb a s a lp o l eo fe l o n g a t i n gs p e r m a t i d s J B i o lR e p r o d 2 0 0 9 8 0 2 3 5 8 3 6 6 易朵 王成 帅勇 等 高迁移率族蛋白H M G B 4 的表达及多克隆抗体制备 J 湖南师范大学自然科学学报 2 0 1 1 3 4 2 6 5 7 0 M U N N I C HA R g T mA C O R M I E R 2 D A I R EV e ta 1 C l i n i c a lp r e s e n t a t i o no fr e s p i r a t o r yc h a i nd e f i c i e n c y M S C R I V E RC R B E A U D E TAL S L YWS e ta 1 T h eM e t a b o l i ca n dM o l e c u l a rB a s e so fI n h e r i t e dD i s e a s e 8 t he d N e wY o r k M cG r o w H i l l 2 0 0 1 2 2 6 1 2 2 7 4 S M E I T I N KJL H E U V E LL D I M A U R OS 2 h eg e n e t i c sa n dp a t h o l o g yo fo x i d a t i v ep h o s