铜绿微囊藻, 四尾栅藻和小环藻竞争实验培养基的选择.doc

杨苏文等：铜绿微囊藻、四尾栅藻和小环藻竞争实验培养基的选择 133铜绿微囊藻、四尾栅藻和小环藻竞争实验培养基的选择杨苏文，金相灿*，姜 霞中国环境科学研究院湖泊生态环境创新基地，北京 100012摘要：改变培养基的氮源形态和碳源浓度，研究铜绿微囊藻、小环藻和四尾栅藻的单藻增长行为，筛选适宜的培养基作为混藻竞争实验的共培养基。研究表明，铜绿微囊藻和四尾栅藻在氨氮培养基中的最大生物量K和最大比增长速率r均不及以硝态氮为氮源的培养基；添加高浓度HCO3-（NaHCO3 1.410 mmol/L）能够提高铜绿微囊藻和四尾栅藻藻细胞对氨氮的吸收能力；较低碳源浓度（NaCO3 0.0943 mmol/L）的培养基中，四尾栅藻的初始比增长速率及生物量远高于铜绿微囊藻，但其最大比增长速率r低于铜绿微囊藻，在实验的第10天左右铜绿微囊藻的生物量超过四尾栅藻；小环藻不能在较高浓度碳源（NaHCO3 1.504 mmol/L）下存活；铜绿微囊藻、四尾栅藻与小环藻均可在以氨氮（HA）或硝态氮（HN）为氮源的培养基中单独培养并达到实验所需生物量，因此，HN和HA可以作为实验室内这三种藻共培养适宜的培养基，为今后研究藻类种间资源竞争机制提供实验依据。关键词：铜绿微囊藻；四尾栅藻；小环藻；培养基；增长行为中图分类号：Q948.11；Q948.12 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2006）01-0129-05表1 培养基主要营养组分及pHTable 1 Major compose of culture media and pH mmolL-1项目M11MG11HNHACHAD1NaNO31.1801.1801.2901.41NH4CL1)2.0562.056NaHCO31.410Na2CO30.1890.1890.0940.0940.094Na2SiO30.1760.1760.1760.1760.352Trace elementA5/2A5/2A5/2A5 2)pH8.08.08.48.07.88.81) 表示无此项；2) A5配方见参考文献8国外有关单藻培养基的研究最早开始于20世纪40年代，主要用于营养型藻类培养基的配方研究，60年代，Fog将各种藻类培养基总结成册1。随着国外工农业的发展，湖泊富营养化问题，特别是藻类水华现象日益严重，使得6070年代人们开始对蓝藻、绿藻和硅藻等单藻生长特性开展深入的研究24，此时所用培养基均基于此书或在此基础上的扩展。70年代中后期藻类竞争日益成为研究的热点后，人们开始探寻能够将两种藻共培养的培养基，最常见的藻类竞争试验是蓝藻与绿藻5、或蓝藻与硅藻共培养6，这种共培养的培养基已经根据不同的实验条件基本成熟。但有关蓝藻、绿藻和硅藻共培养条件下的竞争实验却鲜见报道。根据近几年太湖水华暴发的规律，即春秋季硅藻占优势，夏季蓝藻占优势，绿藻为四季常见藻，基本不形成水华7，因此有必要在实验室内开展不同营养条件下这三种藻的增长特性及相互间竞争关系的研究，这项研究有助于揭示太湖水华发生的机理，为湖泊治理提供理论基础。但开展这方面研究的前提条件就是要找到能够实现3种藻共培养的培养基。本文通过分析3种藻在不同培养基下增长行为的异同，探讨碳、硅和不同形态氮对3种不同类型藻生长的影响，找出单藻培养的最佳营养条件，同时寻找一种能够实现3种藻共培养的培养基，为今后开展该领域的多藻竞争实验奠定最基本的试验基础条件和提供基础实验参数。1 材料与方法1.1 藻种实验用藻种：蓝藻为铜绿微囊藻（Microystis aerufinosa-FACHLB-912）；绿藻为四尾栅藻（Scenedesmus quadricauda-03923）；硅藻为小环藻(Cyclotella-FACHLB-986)；其中四尾栅藻为本实验室从太湖水体分离提纯的藻种；铜绿微囊藻和小环藻均由中科院水生生物研究所藻种库提供。1.2 培养基与培养条件各培养基的主要组分详见表1，主要营养物质摩尔分数见表2（下页）。实验用液体培养基分别为M118, 11、MG11、D19、HN、HA和HAC。其中M11为铜绿微囊藻和四尾栅藻的单藻培养基，D1为小环藻的单藻培养基。MG11为M11中加入0.202 mmol/L Na2SiO3配成；HN为50%的M11与50%的D1混合而成；将HN中1.290 mmol/L NaNO3用2.056 mmol/L NH4CI代替，配成HA；研究表明，HCO3-为藻类良好的碳源12，因此在HA中加入1.410 mmol/L NaHCO3，配成HAC。表2 培养基中主要营养物质摩尔分数Table 2 Mole ratio of major element项目M11MG11HNHACHAD1CNP3181321111248821204CNPSi1)3211411242882112042NPSi2114124282120424411) 表示无此项1.3 实验设计将铜绿微囊藻接种于分别装有150 mL的M11、MG11、D1、HN、HA和HAC等5组培养基的500 mL培养瓶中培养；四尾栅藻分别接种于相同体积的M11、HN、HA和HAC中培养（根据部分实验结果，小环藻在MG11中不能生长，而铜绿微囊藻在D1中不能生存，因此四尾栅藻在这两种培养基中的增长行为没有考察）；小环藻分别接种于相同体积的MG11、D1、HN、HA和HAC中培养。每组设3个重复。将培养瓶置于261 ，光照强度2000 lx的光照培养箱中，光照周期为12 h：12 h，每天摇动培养瓶1次。1.4 细胞增长量的测定和比增长速率的计算细胞增长量的测定采用血球计数板计数。比增长速率采用公式=ln(n/n-1)/(tn-tn-1)，式中为比增长速率，内禀增长率r=max,n、n-1分别为本次与上次细胞计数值，tn、tn-1为对应于n、n-1的培养时间。藻细胞生物量增长小于5%时，结束培养。1.5 接种与取样铜绿微囊藻与四尾栅藻的接种初始密度为5104个/mL，小环藻为5103个/mL。每日取样测定细胞数。1.6 数据整理采用logistic模型拟和藻类的增长过程，应用logistic方程的对数形式设定参数形式，其中，K为最大生物量，N为生物量，r为内禀增长率；用最小二乘法进行参数的估计，并给出参数的95%置信区间；回归方程的显著性检验采用F检验法。2 结果与讨论2.1 铜绿微囊藻在不同培养基下的增长行为LN(K-N)/Nt/db. 对数形式的logistic增长曲线图1 铜绿微囊藻增长曲线Fig. 1 Growth curve of Microystis aerufinosa将铜绿微囊藻在不同培养基中的生长动力学曲线及其对数形式的logistic增长曲线绘制成图1。由图1a可知，铜绿微囊藻在M11、MG11、HN、HAC和HA培养基中能够正常生长，其生长周期均经过了延滞期、对数增长期、稳定增长期3个阶段；但铜绿微囊藻不能在无碳的D1培养基中生存。在M11、MG11、HN和HAC培养基中，藻细胞于第2天进入对数增长期，经过78 d的对数生长，到第1112天进入稳定增长期，第15天达到K；在HA中，藻细胞只在第1天呈现对数增长，之后进入稳定增长期，与其它3种以NO3-N为氮源的培养基相比，藻细胞在以氨氮为氮源的HA培养基中的对数增长期较短，K及r均小于其它3种培养基（见下页表3）。增长行为的差异性表明，铜绿微囊藻在以氨氮为氮源的培养基中利用氨氮合成胞内物质的能力有限，藻细胞在其中表现出与M11、MG11和HN培养基不同的缓慢增长行为。HAC为HA中加入高浓度HCO3-（NaHCO3，1.410 mmol/L）配成的培养基，藻细胞在HAC中的K与r大于HA，与M11持平，表明在氨氮培养基中加入高浓度HCO3-会刺激铜绿微囊藻的增长，提高藻细胞对氨氮的吸收能力；由图1b知，MG11的r大于M11，表明培养基中加入一定量的Si（Na2SiO39H2O，0.202 mmol/L）可促进铜绿微囊藻的生长；同时，藻细胞在HN中，达到的K和r较大（见表3），其中K为M11的3.2倍，MG11的2.2倍，表明HN中添加的微量元素对铜绿微囊藻的增长有较大刺激作用。铜绿微囊藻在NO3-N为氮源的培养基NP为181、241、31，CP为31、31、14的M11、MG11与HN中，及在氨氮为氮源的培养基NP为51，CP为41的HAC中生长良好，在氨氮为氮源的培养基中NP为51，CP为14的HA中也可生长，因此，根据不同实验目的，M11、MG11、HN、HA与HAC培养基均可作为铜绿微囊藻适宜的培养基。表3 不同培养基下铜绿微囊藻纯培养的logistic模型（）拟和参数、回归系数及显著性Table 3 Microystis aerufinosa fit parameter , regress coefficient and sig-nificance of logistic model（）with different culturemedia in pure culture培养基karR2Significance FM11898.336.2060.690*1)0.5930.080*0.956*2)MG111303.006.60.577*0.5980.067*0.968*HN2870.407.411.563*0.6700.181*0.846*HAC1310.006.1190.651*0.5430.077*0.952*HA407.503.1970.645*0.3680.086*0.936*1) *表示95%的置信区间；2) *表示高度显著2.2 四尾栅藻在不同培养基下的增长行为表4 不同培养基下四尾栅藻纯培养的logistic模型（）拟和参数、回归系数及显著性Table 4 Scenedesmus quadricauda-03923 fit parameter, regress coefficientand significance of logistic model（）with different culture media in pure culture培养基karR2Signicance FM111326.303.8830.961*1)0.4450.112*0.860* 2)HN1348.804.4500.887*0.4810.104*0.894*HA482.503.5781.023*0.2050.097*0.720*HAC798.904.6941.394*0.5070.164*0.791*1) *表示95%的置信区间；2) *表示高度显著图2为四尾栅藻在不同培养基中的增长行为。由图2a可知，四尾栅藻在M11与HN中第1天就达到对数增长期，经过67 d的对数增长，藻细胞从第89天进入稳定增长期。由表4及图2b可知，藻细胞在M11与HN培养基中生长的K和r较为接近。表明四尾栅藻在NO3-N为氮源的条件下，对微量元素的添加不敏感。在以氨氮为氮源的培养基中，四尾栅藻的K及r显著低于以NO3-N为氮源的M11和HN，表明四尾栅藻吸收氨氮的能力比吸收硝氮的能力差。同时，在添加了高浓度HCO3-的HAC中，藻细胞的生物量和比增长速率均高于HA，可以认为由于高浓度HCO3-的添加，促进了四尾栅藻对氨氮的吸收，这一规律与铜绿微囊藻相似。根据研究结果5，M11为四尾栅藻的良好培养基，则HN亦可作为四尾栅藻的培养基。根据实验需要，HA亦可作为以氨氮为氮源的四尾栅藻的培养基。a. 四尾栅藻在不同培养基下的增长曲线b. 对数形式的logistic增长曲线图2 四尾栅藻增长曲线Fig. 2 Growth curve of Scenedesmus quadricauda-039232.3 小环藻在不同培养基下的增长行为由于小环藻生长速率较低，本实验从第5天开始计数，由图3a可知，小环藻的生长没有明显的对数增长期，由表5可知，在D1中r最大，生物量也较大；在HN中的K值稍大于D1，但r远小于D1；表明小环藻生物量在无碳环境高于有碳环境（Na2CO3 0.0943 mmol/L）。与铜绿微囊藻和四尾栅藻不同的是，在碳源浓度（Na2CO3 0.0943 mmol/L）相同的条件下，小环藻在氨氮为氮源的培养基HA中的K和r均高于HN，（见图3b及表5）。小环藻在添加高浓度碳源（NaHCO3 1.410 mmol/L）的HAC中始终没有镜检到活藻细胞（增长曲线没有给出），表明高浓度碳源HCO3-对小环藻细胞有强烈的抑制作用。另外，小环藻在MG11中的生长也受到严重抑制（增长曲线没有给出），表明仅加入硅不足以使小环藻保持增长趋势，还需要添加各种微量元素合成胞内物质。总之，在实验室条件下，HN、HA和D1均可作为小环藻培养适宜的培养基,而HAC和MG11不适合作为小环藻培养的适宜培养基。 a. 小环藻在不同培养基下的增长曲线 b. 对数形式的logistic增长曲线图3 小环藻增长行为曲线Fig. 3 Growth curve of Cyclotella-FACHLB-9862.4 3种藻增长行为的比较 a. 4种培养基中铜绿微囊藻与四尾栅藻增长模型的比较b. 4种培养基中铜绿微囊藻与四尾栅藻初始比增长速率的比较图4 铜绿微囊藻与四尾栅藻增长行为的比较Fig. 4 Comparison of growth behave between Microystis aerufinosaand Scenedesmus quadricauda-03923表5 不同培养基下小环藻纯培养的logistic模型（）拟和参数、回归系数及显著性Table 5 Cyclotella-FACHLB-986 fit parameter , regress coefficient and significance of logistic model（） with differentculture media in pure culture培养基KarR2Significance FHN114.002.4090.987*1)0.2120.078*0.728* 2)HA152.503.4390.762*0.2150.072*0.835*D1106.504.8551.065*0.3390.084*0.855*1) *表示95%的置信区间；2) *表示高度显著由图4a可知，除HA外，铜绿微囊藻在M11、MG11、HN和HAC中第1天初始比增长速率为实验周期内的最小值且为负值，表明藻细胞对新接种环境的不适应，形成了细胞生长的延滞期。四尾栅藻在M11、HN、HAC和HA内第1天初始比增长率与铜绿微囊藻相反，为最大值，但其在HA的r仍小于铜绿微囊藻。表明四尾栅藻能够很快适应环境，最大限度贮存并利用营养物质进行增殖。由图4b可知，铜绿微囊藻在HN中第9天及在HAC中第10天，其生物量增长超过了四尾栅藻，Logistic增长模型有交叉点。这一结果表明，在HN和HAC中四尾栅藻初始比增长速率较高，但其对数期的r较低（见表3）；而铜绿微囊藻的初始比增长速率低，但其对数期的r较高（见表2）。Petal认为添加硝态氮后优势种由蓝藻转变为绿藻10。本实验结论与Petal不完全相同：绿藻比蓝藻摄取营养物质的初始比增长速率大于蓝藻，但其r低于蓝藻，在10 d左右蓝藻将超过绿藻的生物量。综合的Petal结论，添加实验优势种转变的规律应为蓝藻绿藻蓝藻，间隔时间大约均为10 d。在HA中两种藻的增长行为与上述规律相反：不论是第1天初始比增长速率，还是r和K，铜绿微囊藻均大于四尾栅藻，增长曲线没有交叉点，表明四尾栅藻在相对低浓度碳源（Na2CO3 0.0943 mmol/L）条件下，对高浓度的氨氮（NH4Cl 2.056 mmol/L）的吸收能力小于铜绿微囊藻。在本实验条件下，硅藻的生长速率较慢，生物量较小，不能与铜绿微囊藻和四尾栅藻形成有效竞争，其主要的限制因子可能为温度，研究表明，温度对硅藻生物量的大小有重要影响13。其在春季形成水华的机理还有待于进一步的研究。3 结论铜绿微囊藻、四尾栅藻与小环藻均可在以氨氮（HA）和硝态氮(HN)为氮源的培养基中单独培养并达到实验所需生物量，这一结论成为今后3种藻共培养的实验基础和依据。铜绿微囊藻和四尾栅藻在氨氮培养基中的最大生物量K和最大比增长速率r均不及以硝态氮为氮源的培养基。铜绿微囊藻和四尾栅藻在添加了高浓度HCO3-（NaHCO3 1.410 mmol/L）后，均促进了藻细胞的增长，表明高浓度HCO3-的加入能够提高这两种藻细胞对氨氮的吸收能力；但不论是否添加额外HCO3-，在以氨氮为氮源的培养基中，铜绿微囊藻的K及r均高于四尾栅藻。以氨氮或硝态氮为氮源及相对较低碳源浓度（Na2CO3 0.0943 mmol/L）的培养基中，四尾栅藻的初始比增长速率及生物量远高于铜绿微囊藻，但其r低于铜绿微囊藻，在实验的第10天左右铜绿微囊藻的生物量超过四尾栅藻。在相对较低碳源浓度（Na2CO3 0.0943 mmol/L）的培养基中，小环藻在以NO3-N为氮源的r高于以氨氮为氮源的培养基；同时，小环藻不能在较高浓度碳源（NaHCO3 1.504 mmol/L）下存活。参考文献：1 FOG G E. 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Then one sort of fitting medium was selected as a multimedium. It is reported that the max biomass and max specific growth rate of Microcystis ae