黄铁矿和斑铜矿中嗜酸氧化亚铁硫杆菌的基因表达调控.doc

黄铁矿和斑铜矿中嗜酸氧化亚铁硫杆菌的基因表达调控摘要 嗜酸氧化亚铁硫杆菌是一种嗜中温，嗜酸，化能自养并且从氧化亚铁，硫元素，硫化合物中获得能量的细菌。嗜酸氧化亚铁硫杆菌的工业应用在于它具有能把不溶于水的金属硫化物氧化成可溶性金属硫酸盐的能力，因此，可以从低品位硫化物矿石中重获所需的金属。在最近的研究中，RAP-PCR被用来辨别斑铜矿和黄铜矿的嗜酸氧化亚铁硫杆菌的细胞生长中有二价铁离子存在和细胞在铜硫化物存在时维持24小时这两种情况的cDNAs表达差异。18个cDNAs相对应的已知功能的基因是相同的，它们的相对表达通过实时定量PCR来进一步表征。斑铜矿对这18个基因表达的分析有温和的影响。黄铜矿表现出最显著的变化。有五个基因在蛋白质加工中起下调作用，另外五个基因在运输系统中起上调作用。本结果显示，基因表达调控很可能对嗜酸氧化亚铁硫杆菌早期对铜的反应很重要。关键词 嗜酸氧化亚铁硫杆菌 黄铁矿 斑铜矿 基因表达介绍嗜酸氧化亚铁硫杆菌是生物湿法冶金操作中应用最广泛的微生物之一。嗜酸氧化亚铁硫杆菌是一种嗜中温，化能自养并且从氧化亚铁，硫元素，硫化合物中获得能量的细菌。嗜酸氧化亚铁硫杆菌的工业应用在于它具有能把不溶于水的金属硫化物氧化成可溶性金属硫酸盐的能力，因此，可以从低品位硫化物矿石中重获所需的金属。嗜酸氧化亚铁硫杆菌被成功应用于在生物浸出中获得铜。黄铜矿和斑铜矿是自然界中普遍找得到的铜硫化物。虽然由相同的元素组成，但他们的溶解特性不同，可能是由于其独特的晶体结构。斑铜矿特别容易溶解在有嗜酸氧化亚铁硫杆菌的存在，黄铜矿更耐细菌攻击，甚至是化学浸出，导致了低溶出率。尽管如此，黄铜矿在采矿行业的经济意义依然存在，因为这种矿石是含铜最丰富的矿物，因此，是一个铜的重要来源。人们对生物浸出过程中的分子生物学方面还知之甚少。嗜酸氧化亚铁硫杆菌的研究集中在了最多样化的问题上，重金属耐受性、营养饥饿和其他方面。此外，由于硅元素的生物信息学分析的到来，已经获得的有关嗜酸氧化亚铁硫杆菌细胞代谢的信息包括硫同化、铁代谢、碳代谢和生物膜形成。一些蛋白质组分析在铜的硫化物存在下的嗜酸氧化亚铁硫杆菌已经在进行。硫代硫酸盐的转移被证明在二价铁存在下会抑制细胞生长，但在铜蓝、黄铜矿和其他金属硫化物中会极大的诱导细胞生长。这些结果表明，该蛋白可能在嗜酸氧化亚铁硫杆菌对矿物的溶解和/或硫代谢中有一个重要的角色。从另一方面看，当铜蓝存在时，铁硫菌蓝蛋白被证明与细胞在二价铁离子存在下生长相比起下调作用。关于嗜酸氧化亚铁硫杆菌细胞维持在有铜硫化物存在的蛋白质方法（Felcio等。2007）表明，当黄铜矿和斑铜矿都存在时，一种蛋白质存在核铜糖二磷酸羧化酶时，其合成受到抑制。有趣的是，在这些铜硫化物中存在一种涉及细胞解毒的抗氧化蛋白存在于诱导蛋白之中。目前的工作旨在查明和评估当黄铜矿和斑铜矿存在时，嗜酸氧化亚铁硫杆菌细胞的基因表达。结果与讨论RNA随即引物PCR法用来识别嗜酸氧化亚铁硫杆菌浮游细胞生长在二价铁离子（控制条件）存在与保持在有黄铜矿和斑铜矿（测试条件）存在下24个小时的cDNAs表达差异。具有最高水平的诱导或抑制的cDNAs是由克隆和测序而来的。测序是为了寻找可在运行BLASTn 算法的TIGR-CMR数据库运行的嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC 23270基因组的相似性。已经鉴定出18个cDNAs相应的基因的功能，并且预测细胞中每个基因的作用是在TIGR-CMR数据库（表1）的基础上分配的。18个选定基因的相对表达是通过实时定量PCR（RTq-PCR，表1.图1）来进一步表征的。预测的18个基因的细胞作用的发现表明，有黄铜矿和斑铜矿存在的培养液中调控基因的表达涉及了运输，蛋白质命运和合成，DNA复制和换位，中央代谢和能量代谢相关基因的表达。运输和结合蛋白在18个确定的基因中，5个与运输有关。这些基因位于基因位于Afe_0074,Afe_0853,Afe_1149(pstA基因),Afe_1592和Afe_3203。位于位点Afe_0074和Afe_3203的基因在铜硫化物存在时表达上调。位于位点Afe_0074的基因编码的一个ABC- 2型运输机的基板是未知的。根据调查，细菌中的ABC转运通常通常与毒力，养分吸收和在各种环境下的运输能力有关。位于基因位点Afe_3203的基因编码的电压门控氯离子通道的门控控制机制是控制膜电位的变化，同时也与氯离子和内外部的pH值有关。在肠道细菌中，氯离子参与了极端酸性反应。 其他三个与运输系统相关的基因在黄铜矿存在下表达上调，但在斑铜矿存在下保持不变。位于位点Afe_0853的基因编码的Na+/H+逆向转运涉及了钠离子的运输，在氢离子的交换中，可能还涉及其他阳离子。因此，这种膜蛋白参与了调节细胞阳离子含量和细胞内pH值平衡。在大肠杆菌中，逆向转运蛋白表达的诱导细胞内钠离子含量和碱性pH值来增加这种感应。除了与pH值的平衡，铁的吸收是这个公认的转运蛋白的作用，根据TIGR-CMR数据库，不能排除它可以运输铁载化合物。嗜酸氧化亚铁硫杆菌细胞被提交给维持在铜硫化物中pH值变化时，这可能解释表达上调的基因编码的转运与pH值的平衡有关，如电压门控氯离子通道（位点Afe_3203）和Na+/H+逆向转运（位点Afe_0853）。位于位点Afe_1149的基因能编码通透蛋白PstA，属于pst操纵子，其基因为高亲和力磷酸盐编码了ABC转运系统。同样的基因，在ABC-2型运输机（位点Afe_0074）编码的pstA基因同时在黄铜矿存在下表达上调。这些基因的表达上调可能是细胞克服基板从亚铁（对照条件）变成黄铜矿的尝试。结果表明，除了磷饥饿，pH值的变化也规范了pst操纵子的表达。因此，另一个在黄铜矿存在下，pstA基因表达上调可能的解释是在嗜酸氧化亚铁硫杆菌细胞的培养中存在这种铜硫化物而导致的pH值变化。位于位点Afe_1592的基因编码的一个TonB依赖受体相关的一个高亲和性铁采集系统是由铁载体介导的。位于位点Afe_1592的基因属于一组基因，其编码的这个铁采集系统的组件包括受体，周质和内在膜转运和能量传导蛋白。铁载体复杂的主动运输所需能量来源于TonB依赖能量转换系统。亚铁甚少与黄铜矿共同存在，这也许可以解释这个基因在铜硫化物存在下的表达上调。符合我们的数据，以前的工作已经证明TonB依赖受体蛋白随着铁限制条件的增加而增加。考虑到基因所述，在黄铜矿和斑铜矿存在下，转运基因的表达变化主要由两种截然不同的情况介导：在铜硫化物存在下的营养饥饿和pH值变化。前者导致的基因表达与营养摄取有关，例如，TonB依赖受体对铁的吸收和磷酸ABC转运对磷酸盐的吸收，而后者导致的基因表达和pH平衡有关，例如，Na+/H+逆向转运和电压门控氯离子通道。蛋白加工的基因6个与蛋白合成和命运有关的基因被确定：hflK(Afe_1200),位于位点Afe_1321的基因，lepA(Afe_1684)， rplP(Afe_2698)，gcp(Afe_2902)和def-2(Afe_3005)。在黄铜矿和斑铜矿存在下，gcp的表达和对照组没有显著差异。另一方面，lepA和def-2在黄铜矿存在下分别表达下调和表达上调，而hflK，rplP和位于位点Afe_1321的基因在黄铜矿存在下表达下调，但在斑铜矿存在下保持不变。Gcp基因编码的一个蛋白肽酶，是一个对细胞表面糖蛋白具有高特异性的蛋白酶。在溶血巴氏杆菌中，这个糖蛋白已被鉴定为一个潜在的致病因子。然而，这不是关于嗜酸氧化亚铁硫杆菌的例子，对于一个非致病细菌来说，gcp基因不变的表达看似合理。lepA和 def-2基因编码的酶分别和蛋白质合成和成熟有关。lepA基因编码了GTP结合蛋白LepA。LepA蛋白被证明在蛋白质的合成中是一个延伸因子。LepA后改名为延伸因子4（EF4），承认和恢复不完全易位核糖体，允许密码子在核糖体A位和随后的mRNA进行适当的的定位。LepA的这种后转运核糖体和错误易位tRNAs确保了蛋白质合成的准确和效率。def-2基因编码的肽脱甲酰是一种细菌生长的关键酶。甲酰参与了新生的蛋白质链翻译后的成熟。去甲酰化的这一步对于进一步去除蛋氨酸氨肽酶中N-末端的蛋氨酸是必要的。有更多的酸性等电位点的新合成蛋白质的去甲酰化的失败和甲酰化肽的累积会导致细菌生长被抑制。hflK基因代码为hflK，是一个与膜蛋白有关的蛋白酶活动。HflK蛋白和HflC蛋白相互作用形成复合物HflKC。FtsH具有复杂的负调节蛋白活性，是一种具有内在活性且需要不稳定蛋白质蛋白降解的蛋白酶。位于位点Afe_1321的基因TIGR-CMR数据可以中被列为未知功能的膜蛋白。经Blastp分析表明位于位点Afe_1321的基因的产物和大肠杆菌YccA蛋白类似。复合物FtsH，HflKC和YccA共同作用于膜蛋白基板和被认为是对质量控制负责的细胞质和膜蛋白。位于位点Afe_2698的rplP基因是另一种和蛋白质合成有关的基因，其表达在黄铜矿中是负面影响。这种蛋白质在核糖体亚基构象中有一个重要作用，从而维持核糖体结构和核糖体50s亚基中氨酰tRNA结合位点适当的方向。考虑到这里的基因与蛋白质加工有关，值得注意的是，嗜酸氧化亚铁硫杆菌细胞中黄铜矿干扰蛋白质的负开启，从而影响到了所有管理蛋白质命运的方面，包括蛋白质的合成、成熟和降解。另一方面，斑铜矿在基因的表达调控相关蛋白质的处理上有相反的作用。lepA 和def-2的表达上调，分别参与了蛋白质合成的准确性和蛋白质的成熟，这似乎表明，蛋白质的合成是在嗜酸氧化亚铁硫杆菌培养中保持黄铜矿存在下触发的。DNA的复制和转录3个在细胞中的作用是DNA的复制和转录的基因被确定：位于Afe_0289的dnaB基因，位于Afe_0467的nrdA基因和位于位点Afe_1751的基因。dnaB基因编码的复制解旋酶蛋白DnaB是对唯一一个对斑铜矿表达上调但对黄铜矿保持不变的基因。在复制交叉中，DnaB解旋酶解开DNA双链，并允许DNA引发酶合成引物，启动每个冈崎片段。在nrdA基因表达中，斑铜矿存在下保持不变，黄铜矿存在下表达下调。nrdA基因编码了核糖核苷酸磷酸还原酶的亚基。作为rNDP还原酶缺乏的后果，dNTP供应量减少和复制交叉进展缓慢甚至是被阻止，可能导致DNA双链断裂。nrdA基因的转录对NrdR阻遏产生负调控，其中NrdR是nrdR基因编码的一种蛋白质。如之前报道的，生物信息学分析使我们确定了一个假定的NrdR结合位点位于nrdA上游地区。在铜硫化物存在下，nrdR的表达模式的评估也是有RTq-PCR检测。虽然在黄铜矿存在下nrdA的表达下调，但nrdR的抑制表达是上调的（数据未表明）。在斑铜矿存在下，nrdA和nrdR的表达都不变。位于Afe_1751的基因的表达在有黄铜矿和斑铜矿存在下与对照细胞比较没有明显差异。嗜酸氧化亚铁硫杆菌中IS元素在染色体DNA中的换位涉及到适应不同的环境条件。总之，这些研究结果表明，DNA介导通过ISAFe2转座的换位不是由铜硫化物的存在触发的，正如这里的黄铜矿和斑铜矿。这些结果的一种可能的解释是在铜硫化物存在下其潜伏期很短（24小时）。能量代谢位于位点Afe_0007和Afe_0965的基因与能量代谢和斑铜矿存在在不变的表达以及黄铜矿存在下表达下调有关。位于位点Afe_0007的基因（sdrA1基因）属于PetI操纵子并编码一个氧化还原酶。PetI基因簇编码细胞色素bc1代电子转移复合物的氧化还原蛋白质。细胞色素bc1复合物与铁氧化和铁电子从NAD（P）转移有关。在黄铜矿存在下，sdrA1基因的表达下调是按照亚铁供给不足而黄铜矿存在和PetI操纵子在铁存在下进行转录考虑的。位于位点Afe_0965的基因编码的醛脱氢酶涉及了发酵过程。这个基因的表达下调似乎表明当嗜酸氧化亚铁硫杆菌细胞维持在黄铜矿存在下并且不是亚铁作为能量来源时，能量代谢收到影响。中央代谢在目前研究中确定的18个基因之外，有2个基因参与了 中央代谢。位于位点Afe_0225的基因编码了一个假定的胆酰甘氨酸水解酶。对于这个基因在只有黄铜矿存在下表达上调这一现象尚没有解释。位于Afe_2728的ribE基因编码了一个核黄素生物合成过程中的重要的酶。核黄素是两个辅酶合成的前体分子。ribE基因在铜硫化物存在下表达不变强调了在细胞新陈代谢中该基因产品的关键作用，正如它的功能活动。总之，基因表现出不同的细胞作用表明嗜酸氧化亚铁硫杆菌LR浮游细胞在黄铜矿和斑铜矿存在24小时下具有表达差异。这项研究结果可能会帮助针对基因可能提交的进一步调查，可以帮助了解在铜硫化物存在下，嗜酸氧化亚铁硫杆菌LR细胞的早期代谢活性。方法金属硫化物试验中所用的金属硫化物为黄铜矿（CuFeS2）和斑铜矿（Cu5FeS4）。研究级的斑铜矿是由沃德的自然科学建立（蒙大拿州，美国），而黄铜矿精矿是从Companhia河谷获得的（巴西）。菌株和培养条件嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株LR是从巴西的铀矿污水中分离出来的，用于实验。这些细胞生长在含有T&K的盐溶液中，包括0.4g/l的K2HPO43H2O, MgSO47H2O 和(NH4)2SO4，辅以二价铁离子（33.4g/lFeSO