利用生物技术用于环境监测方面.doc

浅析蓝藻水华成因以及产毒蓝藻的监测摘要 本文从影响或控制蓝藻水华形成的物理化学因素以及蓝藻本身在水华形成和扩散过程中的生理生态策略阐述了蓝藻水华的发生机理。由于微囊藻素来源于藻并且对人和水生动物具有很高的毒性及潜在危害,因此对藻毒素分析检测的研究对于维护环境安全和人类健康具有重要意义。本文就蓝藻监测的发展概况开始说明，并重点介绍了应用分子生物技术监测产毒蓝藻的优势。由于分子生物技术的高灵敏度，高通量，可定性定量分析蓝藻毒素，在实际应用中得到了广泛的认可。关键词：蓝藻水华；微囊藻素；分子生物技术；PCR Abtract:In this paper, we describes the mechanism of cyanobacterial blooms from the two sides:the physical and chemical factors which influence or control the formation of algal blooms and the eco-physiological strategy during their formation and diffusion. As the microcystins derived from algae ,as for human and aquatic animals ,they have potential hazards and are of the high toxicity . Therefore ,the detection and analysis of algal toxin is of great significance for the maintenance of environmental safety and human health .we begain from the overview on the development of blue-green algae and highlight the advantage of application of molecular biological techniques to monitor toxin-producing cyanobacteria. Considering the high sensitivity, high-throughput, qualitative and quantitative analysis of cyanobacterial toxins of molecular biological techniques can be, in practical applications,it has been widely recognized.Key words: Algal blooms; microcystin ; molecular biotechnology; PCR朗读显示对应的拉丁字符的拼音字典水体富营养化是水体衰老的一种现象，它通常是指水体中氮、磷等营养物质含量过多引起的水质污染现象；是水体中氮、磷等营养物质的增加，引起某些特征性藻类（主要是蓝藻、绿藻）及其他浮游生物的迅速繁殖，水体生产能力提高，系统循环改变，使水体溶解氧含量下降，造成鱼类等水生生物衰亡的水质恶化过程。当环境条件适宜时，浮游生物大量繁殖，形成丝带状或片状物质漂浮在水面上，有时甚至覆盖大面积水域。因占优势的浮游生物的颜色不同水面往往呈现蓝色、红色、棕色、乳白色等，这种现象在淡水水体中称为“水华”，在海洋中则称为“赤潮”。蓝藻水华是富营养化淡水水体中发生最多、影响最大的藻类水华。我国近年的调查研究显示，除了太湖和滇池等已出现因蓝藻生长而引起的严重水污染外，长江、黄河中下游许多水库、湖泊也出现不同程的藻类水华污染情况。这种现象正朝着频率提高、面积增大、损失加大的趋势发展12。1. 蓝藻水华的成因蓝藻水华的发生具有明显的季节性、连续性，温度、光照、营养物质、气候条件等都有可能成为水华暴发的制约因素。一般认为水华的发生机理可归结为两个方面：一是非生物方面的因素，即影响或控制蓝藻水华形成的物理化学因素；二是生物方面的因素，即蓝藻本身在水华形成和扩散过程中的生理生态策略。1.1 物理因素：（1）水体的滞留时间。如果水的流出速度大于水华种类的生长速度，有可能抑制水华的产生。（2）水体大面积的垂直混和，能抑制浮游藻类的聚集。（3）水体小范围的混和，能影响丝状体和群体蓝藻种类的混和。（4）光的屏蔽能改变浮游植物的群落组成，可能对水华蓝藻有负面影响。（5）温度大于20时有利于水华的形成。1.2 化学因素：（1）pH变动。可能改变浮游植物的群落组成，低pH（8.0）有利于蓝藻生长。（2）营养物的输入(N和P)。长期地减少N和P输入能有效地防止水华；由于P的负荷增加所导致的低N：P比（20）常促进水华。（3）盐度。千分之几盐度的提高(如NaCl)能阻止某些水华种类的发展和持续时间。（4）微量元素。在高N和P负荷下，可利用Fe下降常抑制其他浮游藻类的生长，但蓝藻能有效地竞争低浓度的Fe。1.3 生理生态策略水华的形成和扩散也是蓝藻生理生态策略的表现。蓝藻水华的发生主要有如下生物学机制：（1）固氮机制蓝藻形成和扩散水华的生理生态策略之一，是它们能够以不同的方式（空间隔离或者时间隔离方式）创造细胞内厌氧微环境，进行固氮。形成水华的蓝藻如鱼腥藻、水华束丝藻、拟筒胞藻等，它们特有的异形胞能够将大气氮固定为可利用氮源，供给其他营养细胞，因此在环境中外来氮源不足而水体磷充足时，它们比其他生物更具有竞争优势，容易周期性地大量生长形成水华。（2）低光补偿机制水深加剧太阳辐射的衰减，影响初级生产者的光合同化，富营养型水体较大的浊度更使光合作用受到更强的抑制，因而，耐低光强生长的物种在形成水华的竞争中具有优势。放氧光合生物都是两套捕光色素系统，叶绿素类色素和类胡萝卜素类色素。分别将捕获的光能传递到叶绿素反应中心，进行光合碳同化。而蓝藻特殊地具有三套色素系统，还有藻胆色素系统，藻蓝色素和藻红色素，使它们的捕光光谱更宽，在弱光条件下吸收的光能的本事更大，光强1000lux左右的条件他们能够很好生长，进行放氧光合作用，使这类生物在浑浊的富营养型水体能够克服“低光、缺氧”的障碍生存繁衍。（4）无机碳浓缩机制水华蓝藻具有高效吸收利用外源无机碳的功能无机碳浓缩机制(Ci-Concentrating Mechanism，CCM)。在低浓度的CO2介质中，蓝藻可以主动地高效吸收浓缩外源无机碳，在细胞内积累比介质高几百到几千倍的CO2浓度，由此能够在其所栖息的环境中最大限度地竞争利用有限的无机碳源保持持续稳定的生长。蓝藻二氧化碳浓缩机制的有效运转，还极大地抑制了细胞的光呼吸现象，有效地减低了不必要的生物能量耗损。（5）奢侈消费机制水华蓝藻往往吸收过量的磷、氮、碳素营养，以一种特别的形式（如多磷酸体）储藏在细胞内，十分“奢侈”。然而，这一机制使之不因水体微环境的变化而发生“供应不足”，相反，它们能够始终保持旺盛繁衍的状态，除非细胞本身或者种群演替进入迟滞阶段。由于这个原因，取自滇池（及试验区）的水样一旦去除了其中的固体悬浮物（SS，多半是水华蓝藻的细胞团颗粒），总磷就大大降低，因为蓝藻细胞含有很高的磷。这从一个侧面反映去除水华蓝藻生物量（以机械或生物的方式）并使之被取出水体，是削减内源营养负荷的一个重要途径。（6）休眠机制水华蓝藻都有一套休眠机制，表现的形式虽然不一样，有的形成厚垣孢子，有的形成藻殖段，有的只是简单地形成非专性结构的休眠体，但是都能在条件不利时借这种休眠机制沉入底泥，度过“难关”。一旦条件好转，这些休眠体就复苏，萌动，繁殖，上浮乃至再形成水华。（7）生态位替补竞争机制水华蓝藻形成持续水华达到“暴发”的程度，绝不是一个物种的原因，通常都是几个、十数个甚至数十个浮游蓝藻物种同时存在，适应生存环境中的任何微小变化而由其中最适、最能竞争的物种成为优势种。环境微变化对一个物种不适，另一物种在“自动”继而发生。2蓝藻水华的危害蓝藻水华污染所带来的主要危害是在有毒蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种不同类型的藻毒素。这些蓝藻毒素的释放直接对鱼类、人畜产生危害。蓝藻毒素依据其最终导致的病症的不同可以分为神经毒素、肝毒素、细胞毒素和刺激性毒素4大类。在这四类毒素中,肝毒素和神经毒素对人体健康危害最大,严重的会引起其死亡。在已发现的各种不同藻毒素中,微囊藻毒素是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。微囊藻毒素产生并主要包含在蓝藻活细胞内,但当细胞衰老、死亡或溶解后,则释放到水体中。大型湖泊、河流中蓝藻释放的藻毒素可被大量水体稀释,但高浓度、大面积水华溶解时,仍会使毒素达到较高浓度,给水体使用者造成潜在危害。 微囊藻毒素与人类健康密切相关,由微囊藻毒素所引起的人类急性、慢性中毒事件时有报道。近30年来约有10000人由于饮用或直接接触污染微囊藻毒素的水而造成急性中毒,其中100多人死亡3。研究表明人们直接接触含微囊藻毒素的水华，如在湖泊、河流、水库中进行游泳等娱乐活动，会引起皮肤、眼睛过敏，发烧，疲劳以及急性肠胃炎，如果经常暴露与含毒素的水体，会引发皮肤癌、肝炎及肝癌。饮用含有微囊藻毒素的水，人群肝癌的发病率明显高于饮用深井水。人类对蓝藻毒素的摄入也并不一定仅通过饮水、直接接触和血透析等途径，由于蓝藻毒素大多可以在水生动物体内富集和积累，因此，人类在食用了受污染水体中的鱼类、贝类等可能携带蓝藻毒素的水产品时，毒素就会通过食物链的传递和放大作用而导致人群中毒45。由于微囊藻毒素专一性地作用于肝脏，是极强的促肿瘤剂，其对人类健康的危害正日益受到全世界的关注。3产毒蓝藻的监测由于微囊藻素来源于藻并且对人和水生动物具有很高的毒性及潜在危害,因此对藻毒素分析检测的研究对于维护环境安全和人类健康具有重要意义,世界卫生组织规定饮用水中的微囊藻素浓度不得高于1g/L。同时,围绕如何检测、控制和消除蓝藻毒素,各国的科学工作者开展了大量的研究工作。3.1 产毒蓝藻监测的发展概况由于技术条件的限制,早期对产毒蓝藻的诊断只能依靠传统的生理学和形态学特性(如,藻细胞形状、大小)来进行判断。而事实上,蓝藻的形态特性与其是否具有潜在的产毒能力并没有多少相关性。因此早期只能通过构建相应的生物模型进行生物毒性实验以检测水体中是否有蓝藻毒素存在。然而,较低的灵敏度、较高的实验耗费以及生物毒性实验带来的一系列伦理问题,使得人们不得不选择别的方法来对蓝藻毒素进行诊断。随着微量样品分析仪器(如 HPLC、MALDI-TOF)的发展,依托这些仪器开发出多种用于检测自然水体中蓝藻毒素的物理化学方法67。这些物理化学分析方法主要包括液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)和薄层层析(TLC)等方法,可对微囊藻素进行准确定量测定。因为微囊藻素的种类繁多且对人类和动物的毒性效应比较相似,故日本学者研究出了测定总微囊藻素的方法89,其原理是用碘酸钠和高锰酸钾对微囊藻素进行初步氧化后,可产生一种共同的中间产物赤-2-甲基-3-甲氧基-4-苯基酪酸(MMPB)，通过用气相色谱对MMPB进行测定,可间接获得总微囊藻素的浓度,但无法对各种微囊藻素的类型进行区分。这些方法分析过程简单快捷并且具有很高的灵敏度。然而,由于分析仪器对样品的前处理有着很高的要求,因此在实际运用中,样品的处理变得既费时又费力,并且昂贵的分析仪器和标准品也使得许多实验室无法开展对蓝藻毒素的诊断。依靠免疫学和生物化学的方法开发出的诊断手段也逐渐运用于实验室或自然环境水体中蓝藻毒素的检测。如,对肝毒素进行检测的ELISA方法、比色法(蛋白磷酸酶抑制剂)和细胞毒性诊断10。蛋白磷酸酶抑制法检毒素是利用微囊藻毒素对蛋白磷酸酶(PP1,PP2A)活性的专一性抑制，依据活性抑制和毒素含量相关关系来测定毒素方法。常用的有同位素标记法和微量比色法，目前常与色谱(如HPLC)结合使用，该法灵敏度高，一般可达到纳克级，极限匹克级。3.2 早期分子生物学技术在产毒蓝藻诊断中的运用然而,前述多种诊断方法,均以释放至水体中的蓝藻毒素为检测对象,不能在毒素从藻细胞内释放到水体之前对其进行预判断。因此,无法通过这些方法对潜在的产毒蓝藻进行预检。生物监测技术是环境监测研究的新方向，其从分子水平研究在污染物作用下生物体内各种指标的变化，作为联系污染物与生物效应之间的纽带，它既可以揭示环境样品和生物体内污染物的浓度，还可以反应污染物的毒性，成为污染物的暴露与效应最灵敏的监测指标，对于环境污染的探查和快速筛选、环境健康的风险评价及污染物长期毒性效应的早期预报具有重要意义。以分子生物学为基础进行的检测,则从基因角度对蓝藻毒素进行检测,以确定水体中是否含有潜在产毒能力的藻株,从而对被测水体是否对人类健康存在潜在危害做出判断。同时分子生物学检测方法由于其简单、快速、经济等优点,逐渐成为各国学者关注的热点1113。通过大量的实验观察,发现并不是所有的蓝藻种类中都具有产毒能力,产毒蓝藻往往局限在某些特定的属种中。因此在早期,尤其是在蓝藻毒素生物合成途径没有发现之前,基于16S rRNA和转录间隔区( ITS)序列并结合限制性片段长度多样性(RFLP)的传统遗传多样性分析成为鉴定和区分产毒蓝藻和非产毒蓝藻的主要手段1416。但随着研究的深入,发现这种基于16S rRNA序列的遗传多样性分析,并不能很好区分产毒藻株和非产毒藻株。在一些藻属中假阳性或假阴性的检出率很高,严重的影响了最终结果的判断1718。特别指出的是,这一诊断方法对于鉴定和区分Nodulariasp.中潜在的产毒藻株和非产毒藻株是十分有效的。3.3 以产毒基因为靶标进行的产毒蓝藻诊断目前,包括microcystin和nodularin在内的一些蓝藻毒素的生物合成途径已基本清楚,通过对生物合成途径分析发现,这些蓝藻毒素(microcystin &nodularin)均是由非核糖体肽合成酶(NRPS)和聚酮合成酶(PKS)杂合形成的多酶复合体系催化合成的。microcystin的合成酶基因mcy包含mcyABC(多肽合成酶)和mcyDEFG(杂合的多酮-多肽合成酶)2个主要操纵子。mcyA、mcyB、mcyC这3个基因共同编码5个模件(module),负责合成mi-crocystin结构中Mdha、D-Ala、L-Leu、D-MeAsp和L-Arg。而mcyD、mcyE、mcyF、mcyG,这4个基因组成的操纵子位于mcyA的上游,与mcyABC组成的操纵子方向相反,负责microcystin结构中Adda和D-Glu的合成19。负责合成microcystin的mcy基因在Mi-crocystis、Anabaena、Planktothrix等多个蓝藻属中均以发现,基因片段的长度和结构略有不同。这些研究工作的完成奠定了以产毒基因为靶标进行产毒蓝藻毒素检测的基础,使运用分子生物学手段对潜在的产毒蓝藻进行预检成为可能。众多学者以microcystin合成基因簇中的基因mcyA和mcyB为靶标设计特异性引物以用于有毒蓝藻的检测并得到不错的检测效果。除基因簇中的mcyA和mcyB外,microcystin合成基因簇中的其他基因也作为靶标,或单独、或作为辅助手段用于有毒蓝藻的检测20。除此之外,以产毒基因为靶标结合定量PCR技术(Q-PCR)可以时时监控自然水体中某一类具有潜在产毒能力的蓝藻藻株的动态变化过程,以便及时采取相应的对策以防有毒蓝藻“水华”的发生。4. 结论面对蓝藻水华的肆意发难，目前迫切需要进行研究的内容有:寻找导致水华形成的各主要生理阶段的触发因子或特异性因子。如:蓝藻如何越过冬天的低温及湖底的低光照乃至黑暗环境?在这种特殊的环境中藻类生存的极值是什么?蓝藻在春季复苏的触发条件及其生态阈值?蓝藻在与其它藻类种群竞争中取胜的生理与生化特征?蓝藻过度增值的主导因素?蓝藻的气囊的形成、浮力控制的条件等。带着上述的疑问，在利用分子生物技术的优势的基础上我们将逐步弄清蓝藻水华的形成机制。并且对其发生的每一进程进行早期预测,寻求更加具有针对性的控制措施,尽量减少由于蓝藻水华导致的水质恶化带来的经济与社会危害。参考文献1高爱环，李红樱，郭海福。水体富营养化的成因、危害及防治措施。肇庆学院学报，2005，26：41-442卢兆曾，李纪忠。水源富营养化问题及危害。山东水利，2005，3：16刘永定。蓝藻水华暴发的主要生物学机制。第十二届中国藻类学研讨会论文摘要集，2003，1413Codd G.A.Cyanobacterial toxins,the perception of water quality,and the prioritisation of eutrophication control.Ecological Engineering,2000,16:51-604Duytn,Lampks,Shaw G.R.Toxicology and risk assessment of freshwater cyanobacterial(blue-green algae)toxins in water.Rev.Environ.Contam.Toxicol.,2000,163:113-1865Pereira P.,Onodera H.,Andrinolo D.,Franca S.,Araujo F.,Lagos N.,Oshima Y.Paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium Aphanizomeno flos-aquae,isolated from Montargil reservoir,Portugal.Toxicon,2000,38:1689-17026Jussi M. 1997. 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