原子吸收分光光度法标准操作规程.doc

原子吸收分光光度法标准操作规程1 简述供试品在高温下经原子化产生原子蒸汽时，如有一光衍射作用于原子，当辐射频率相当于原子中电子从基态跃迁到较高能量时，即引起原子对特定波长的吸收。吸收通过发生在真空紫外、紫外及可见光区。原子吸收光谱为线光谱，通过测定该特征光谱线的吸光度可以计算出该待测原始的含量。原子吸收一般遵守吸收分光光度法的比尔定律，试验条件固定时特定波长处的吸光度值与样品中原子浓度成正比。但实验参数的变化会影响结果值。原子吸收分光光度法的测量对象是呈原子状态的金属元素和部分非金属元素。测定的样品一般经高温破坏成原子态，在气态下利用自由原子的光谱性质进行测量，常用在药物中无机元素的测定。1.1 仪器 原子吸收分光光度计主要由光源、原子化器、单色器、检测器、记录显示系统和数据处理系统等部分组成。1.1.1 光源 由于原子光谱为线光谱，原子吸收分光光度计的光源应能在窄的光谱范围内有高强度的辐射，否则检测器得不到准确测量信号。因此，需要应用能满足上述要求的线光源。原子吸收分光光度计常用的光源为空心阴极灯。灯的阴极由待分析元素的物质构成，工作时使该元素激发并发射特征光谱。被测元素只能用该元素的空心阴极灯进行分析。 1.1.2 原子化器 常用的原子化器有主要有火焰型、电热型、氢化物发生型和冷蒸汽型四种。火焰型原子化器 样品溶液导入雾化器成气溶胶，并与燃气和助燃气充分混合后在燃烧器上成火焰燃烧，不同物质需要不同能量使其离子态转变成基态的原子。入射光通过基态原子时部分能量被吸收，并由传感器转变为电信号，用记录仪进行记录。改变燃气和助燃气的种类及比例可以控制火焰的温度，以获得较好的火焰稳定性和测定灵敏度。最常用乙炔-空气火焰。电热型原子化器 又称无火焰原子化器，其中又以石墨炉应用最广。石墨炉原子化器为用电流控制温度的炉子，其中放入可置放样品的石墨管或其他合适的样品置放装置。在测定过程中炉内通入氩或其他保护气体，以防止炉的氧化。以一定体积的样品溶液加入石墨管后用电加热使其原子化。电加热的过程至少有三个阶段：干燥阶段用略高于溶剂沸点的温度，以较长时间使溶剂蒸发至干。灰化阶段是去掉比分析元素容易挥发的样品基体以减少背景吸收，根据具体情况选择合适的灰化温度及时间。最后阶段为原子化阶段。温度应升至能使样品转变成气态原子，该阶段的升温速度必须很快，加热时间应尽可能短，以延长石墨炉的寿命。原子蒸气迅速从入射光束通道中扩散出去，形成一个瞬态吸收信号，用记录仪记录。 冷蒸气原子化器：测汞时，在汞蒸气发生器中，汞离子被还原成汞，然后将汞蒸气直接导入原子吸收池中。 1.1.3. 单色器 通常用衍射光栅为色散元件。仪器光路应能保证有良好的光谱分辨率和在相当窄的光谱带（0.2nm）下正常工作的能力。单色器的结构与一般紫外可见分光光度计相同。1.1.4.检测器 一般采用对紫外及可见光敏感的宽光谱工作范围的光电倍增管作为检测元件。要求检测器的输出信号灵敏度高、噪声低、漂移小及稳定性好。1.1.5 记录仪和数据处理系统 原子吸收分光光度计常用绘图打印机记录测定结果。数据处理系统需能测量信号积分值和制备标准曲线以及统计计算处理。有的仪器将参数设定操作系统和数据处理系统放在一起工作。1.2 背景校正的消除 背景吸收干扰是原子吸收测定中常见的现象。造成背景干扰的原因多种多样，并往往随样品情况的变化而变化。一般认为，背景来源于样品中共存组分及其在原子化过程中形成的次生分子或原子的热发射、光吸收和光散射。其中有些干扰可以通过适当的样品前处理或优化原子化过程的条件得以消除或减少，但许多干扰仍难以避免。必须另辟蹊径，通过改进仪器设计予以克服。 背景校正的基本原理是将分析谱线两侧的读数作为背景读数，然后从分析线的峰值读数中扣除之。最常用的背景校正方法有三种：一是连续光源校正法，采用两个光源，主光源为线光源（即空心阴极灯），另一光源为连续光源，在紫外区通常用氘灯。来自线光源的样品光束通过样品时，其吸光度读数为待测元素与背景吸收之和，来自连续光源的参比光束通过样品时测定背景读数，二者之差即为校正的待测元素的吸光度。二是塞曼效应校正法，多电子原子的发射谱线通过强磁场时，由于空间量子化的缘故使谱线发生分裂，分裂后的中心线称成分，两侧射线称+成分。成分作为样品光束测定样品和背景的总吸光度，+作为参比光束测定背景吸收，二者之差即为样品吸收。三是强脉冲自吸校正法，在空心阴极灯的工作周期内依次施加两个不同强度的脉冲，在弱脉冲作用下发射正常的谱线，在强脉冲作用下多普勒效应和阴极溅射增强，从而使谱线变宽而且引起明显的自吸收，造成辐射能在中心波长处缺失而分布于中心波长的两侧。将弱脉冲作用下的发射谱线作为样品光束，强脉冲作用下的自吸谱线作为参比光束，依次测定吸光度，以实施校正。连续光源校正由于使用双光源，样品光束和参比光束的准直较为困难，导致在高背景时校正不足或补偿过度；另外，当共存元素的吸收线邻近分析线时，也往往造成补偿过度。塞曼背景校正没有上述缺点，但当样品浓度较高时，工作曲线向浓度轴弯曲。强脉冲自吸校正效果较好，但仍存在高浓度时工作曲线弯曲及灯寿命缩短等缺点。2 原子吸收分光光度计的检定2.1 波长准确度与重复性 根据中华人民共和国国家计量检定规程JJG694-90的规定，双光束原子吸收分光光度计的波长示值误差不大于+0.5nm，波长重复性优于0.3nm。2.1.1 波长准确度与重复性检定方法 按空心阴极灯上规定的工作电流，将汞灯点亮稳定后，在光谱带宽0.2nm条件下，从汞、氖谱线253.7/365.0/435.8/546.1/640.2/724.5和871.6nm中按均匀分布原则，选取35条逐一作3次单向（从短波长向长波长方向）测量最大能量波长示值，计算谱线波长测量值与标准值的平均 。波长重复性为3次测定中最大值与最小值之差。2.2 分辨率 仪器光谱带宽为0.2nm时，应可分辨锰279.5nm和279.8nm的双线。2.2.1 分辨率检定方法 将锰灯点亮，稳定后在光谱带宽为0.2 nm时调节光电倍增管高压，使279.5nm谱线的能量读数为100，然后扫描测量锰双线，应能明分辨出279.5和279.8 nm两条谱线，且两线间峰谷能量应不超过40。2.3 基线稳定性检定 火焰原子化法测定30min内静态基线和点火基线的稳定度，应不大于下表的指标。2.3.1 基线稳定性检定法2.3.1.1 静态基线稳定性的测定 光谱带宽0.2 nm，量程扩展10倍，点亮铜灯，在原子化器未工作的状态下测定。单光束仪器与铜灯同时预热3 min，用“瞬时”测量方式，或时间常数不大于0.5s，测定324.7nm谱线的稳定性。双光束仪器预热30 min，双光束仪器预热30min，铜灯预热3 min，按上述相同条件测定。2.3.1.2 点火基线稳定性的测定 按测铜的最佳条件，用乙炔/空气火焰，吸喷去离子水10 min后，在吸喷状况下，重复2.3.1.1的测量。2.4 边缘波长能量 带宽为0.2 nm，响应时间不大于1.5 s的条件下，对砷193.7 nm和Cs852.1nm谱线进行测量，谱线的峰值应能调到100，背景值/峰值应不大于2。5min内谱线的最大瞬时噪声(峰-峰值)应不大于0.03A。谱线能量为100时，光电倍增管的高压应不超过最大高压值的85。2.5 火焰法测定铜的检出限 (CL(n= 3)和精密度（RSD）使用中的仪器应分别不大于0.02ug/ml 和1.5。2.5.1 检出限的测定 仪器参数调至最佳工作状态，用空白溶液0.05mol/L硝酸调零，分别对三种铜标准溶液（0.50、1.00、3.00ug/ml）各进行三次重复测定，取三次测定平均值，按线性回归法求出工作曲线的斜率，即为仪器测定铜的灵敏度(S)。SdA/dCA/(g/ml)在上述条件下，扩展标尺10倍，对空白溶液 (或浓度三倍于检出限的溶液) 进行11次吸光度测量，并求出其标准偏差 (SA)，计算铜的检出限如下CL(n = 3) 3SA/S(g/ml) 2.5.2 精密度的检定 在（2.5.1）测定中选择标准溶液之一，其吸光度在0.10.3范围进行七次测定，求出相对标准偏差(RSD)，即为仪器测铜的精密度。2.6 石墨炉原子化法测镉的检出限 (QL(n = 3)，特征量（C.M.）和精密度（RSD），使用中的仪器应分别不大于4pg、2pg和7。2.6.1 检出限和特征量的检定 仪器参数调至最佳工作状态，分别对空白溶液（0.5mol/L硝酸）和三种镉标准溶液（0.50、1.00、3.00ug/ml）各进行三次重复测定，取三次测定的平均值后，按线性回归法求出工作曲线斜率，即为仪器测量的灵敏度 (S)。S dA/dQ dA/d(C V) (A/pg) 式中 C溶液浓度 (ng/ml)；V取样体积 (l)。在上述条件下，对空白溶液进行11次吸光度测定，并求出其标准偏差 (SA)。计算镉的检出限如下：QL(n = 3) 3SA/S (g)仪器测定镉的特征量如下C.M.0.0044/S(pg)2.6.2 精密度的检定 在（2.6.1）测定中，对3.00 ng/ml的镉标准溶液进行七次重复测定，即为仪器测镉的精密度。2.7 火焰法中样品溶液的吸喷量 (F)和表观雾化率() 应用本法可测定火焰原子化雾化的效率，样品的吸喷量应不小于3ml/min；雾化率应不小于8。2.7.1 吸喷量和表观雾化率的检定 在与2.5相同条件下，在10 ml量筒内注入去离子水至10ml刻线，将毛细管插入量筒底部，同时启动秒表，测量1 min时间内量筒中水所减少的体积，即为吸喷量 (F)。取出进样毛细管，至废液管出口无废液排出后，将该管放入有一段水封的10 ml量筒 (量筒1)内。另一量筒 (量筒2) 内注入10 ml水，在上述条件下将毛细管插入水中，至10 ml水全部吸喷完毕，废液管中无废液排出后，测量排出的废液体积V (ml)，并计算表观雾化率 ()：10V= 10 100%2.8 背景校正能力 背景信号约为1A时，校正后的信号应不大于该值的1/30。2.8.1 火焰原子化器的仪器在镉228.8 nm波长时先用无背景校正方式测量，调零后将吸光度约为1A的屏网插入光路读得吸光度A1，再在背景校正方式调零，插入屏网读取吸光度A2。A1/A2值应符合2.8的规定。2.8.2 石墨炉原子化器的仪器参数调至测镉的最佳状态，先用无背景校正方式，用移液管加一定量的氯化钠溶液 (5.0 mg/ml)溶液使产生1 A左右吸光度信号，读取吸光度（峰高法）A1，再用有背景校正方式全样测定，读取吸光度A2，A1/A2值应符合2.8的规定。3 样品测定操作方法 3.1 标准曲线法 在仪器推荐的浓度范围内，制备含待测元素的标准溶液至少3份，浓度依次递增，并分别加入供试品溶液配制中的相应试剂。同时以相应试剂制备空白对照溶液。将仪器按规定启动后，依次测定空白对照溶液和各浓度对照品溶液的吸光度，记录读数。以每一浓度3次吸光度读数的平均值为纵坐标、相应浓度为横坐标，绘制标准曲线。按各品种项下的规定制备供试品溶液，使待测元素的估计浓度在标准曲线浓度范围内，测定吸光度，取3次读数的平均值，从标准曲线上查得相应的浓度，计算元素的含量。 第二法（标准加入法）取同体积按各品种项下规定制备的供试品溶液4份，分别加至4个同体积的量瓶中，除（1）号量瓶外，其他量瓶分别精密加入不同浓度的待测元素标准溶液，分别用去离子水稀释至刻度，制成从零开始递增的一系列溶液。按上述标准曲线法自“将仪器按规定启动后”操作，测定吸光度，记录读数；将吸光度读数与相应的待测元素加入量作图，延长此直线至与含量轴的延长线相交，此交点与原点间的距离即相当于供试品溶液取用量中待测元素的含量（如图）。再以此计算供试品中待测元素的含量。此法仅适用于第一法标准曲线呈线性并通过原点的情况。当用于杂质限度检查时，取供试品，按各品种项下的规定，制备供试品溶液；另取等量的供试品，加入限度量的待测元素溶液，制成对照品溶液。照上述标准曲线法操作，设对照品溶液的读数为a，供试品溶液的读数为b，b值应小于（a-b）。4 测量操作注意事项4.1 样品取样要有代表性，取样量应根据被测元素的性质、含量、分析方法及要求的分析精度决定。标准样品的组成应尽可能与被测样品接近。4.2 仪器参数选择如空心阴极灯工作电流、光谱带宽、原子化条件等。火焰原子化器中火焰条件的选择如火焰类型，燃气和助燃气的比例，供气压力和气体流量等。石墨炉原子化器应注意干燥-灰化-原子化各阶段的温度、时间、升温情况等程序的合理编制。它们对测定的灵敏度、检出限及分析精度等都有很大的影响。许多仪器一般能提示或自动调节成常用的参数，使用时可按实验情况予以修改。4.3 原子吸收分光光度法实验室要求有合适的环境，室内应保持空气清净，较少灰尘，应有充足、压力恒定的水源，仪器燃烧器上方应有符合厂方要求的排气罩，应能提供足够而恒定的排气量，排气速度应能调节，排气罩以耐腐蚀、不生锈的金属板制造为宜。 使用原子吸收分光光度计时对实验室安全应予以特别注意，如排气通风是否良好，突然停电、停水及气流不足或不稳定时的安全措施等。本仪器具有自动安全功能，发现故障后一般停止工作。但实验室环境的安全仍需使用者随时注意。4.4 原子吸收分光光度法灵敏度高，极易受实验室各种用品的污染，常见的污染源如下。4.4.1 水 应用去离子水或用石英蒸馏器蒸馏的超纯水。钠、钾、镁、硅、铁等元素最易沾污实验室水。贮藏水的容器一般用聚乙烯塑料等材料制成。玻璃瓶久贮会将瓶中微量污染元素溶解在水中。4.4.2 试剂 制备样品用的酸类、溶剂及有机萃取剂等为主要玷污来源之一，应采用高纯试剂。4.4.3 实验室容量其，器皿烧杯、容量瓶、移液管等尽可能使用耐腐蚀塑料器皿，而不用 器皿。因为玻璃器皿易吸附或吸收其他金属离子，在使用过程中缓缓释出。自动进样器应尽量不用能直接接触样品的金属附件及金属针头。样品前处理用的通风橱可能有积尘、锈蚀物或粉尘、气流等影响。大气中尘埃的污染特别对石墨炉的高灵敏度检测有很大的影响。样品处理过程及处理完后分析时应尽可能防止外界尘埃落入，产生干扰。4.5 标准溶液一般浓度大于 1000ug/ml的可以作为贮备液贮存在耐腐蚀容器中，浓度低于10ug/ml的工作溶液应注意稀释溶剂及试剂对其污染的影响，浓度低于1ug/ml的标准溶液应在使用当天配制使用，不宜贮存。4.6 样品一般处理成溶液后进行分析，因此样品的前处理十分重要。处理方法很多，无机物常用酸进行溶解，复杂基体的样品常需用熔融、有机萃取、加入改进剂等方法消除基体干扰及化学干扰等因素。生物样品往往需经湿法或干法灰化，萃取或加基体改进剂消除基体干扰及化学干扰等措施以使分析顺利进行。石墨炉的样品测试可以采用固体直接放在石墨管或是没平面中进样。难以避免的干扰有时可用掩蔽剂消除。 4.7 石墨炉的分析重现性及精度的关键操作之一为进样方法的重现性。从石墨炉的小孔中加入样品时，除石