水产品中无色孔雀石绿胶体金免疫层析法检测.doc

水产品中无色孔雀石绿胶体金免疫层析法检测【关键词】 胶体金;免疫层析;无色孔雀石绿;水产品无色孔雀石绿(Leucomalachite green,LMG)是孔雀石绿(Malachite green,MG)在生物内的主要代谢产物和存在形式，已被确证具有高毒性、高残留及三致等毒副作用，主要污染水产品，世界各国均立法禁止使用并进行强制检测1-2。胶体金免疫层析法(GICA)是20世纪80年代初发展起来的一种新型快速免疫检测技术，具有特异性强，操作简便快捷，成本低廉等优点，已在医学检验、毒品监控、食品安全等领域得到广泛应用3-5。本研究旨在将金标免疫层析法检测技术应用到水产品LMG的检测中，为样品的现场快速测定提供新的方法。1 材料与方法1.1 试剂及设备 氯金酸(AR级，上海化学试剂厂);无色孔雀石绿(德国Sigma-Aldrich公司);无色孔雀石绿抗体(江苏省苏微微生物研究有限公司制备);牛血清白蛋白(BSA);卵清蛋白(OVA)，羊抗兔二抗(德国Sigma-Aldrich公司);硝酸纤维膜、玻璃纤维膜(美国Millipore公司);紫外可见分光光度仪(GBCCINTRA10e，澳大利亚GBC公司);磁力搅拌器(RCTbasic，德国IKA公司);冷冻离心机(himac CR22F，日本HITACHI公司);点膜机(美国bio-dot公司);微量移液器(Thermo，美国热电公司);pH计(320型，瑞士梅特勒-托利多公司)。1.2 GICA试纸条制备1.2.1 胶体金制备6 取0.1 g/L氯金酸溶流70 mL加热并搅拌，沸腾后立即加入10 g/L柠檬酸水溶液2.1 mL，搅拌至溶液呈稳定桔红色，继续反应10 min，停止。1.2.2 胶体金抗探针的制备7 取30 mL胶体金溶液，用Na2CO3将pH调为9.0，滴加0.72 mL 0.5 g/L的LMG抗体，搅拌5 min。静置30 min后，4 ，7 500 r/min高速离心40 min，弃上清，沉淀用含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，离心，弃上清，沉淀用0.5 mL含5% BSA的PBS缓冲液溶解，4 保存备用。胶体金粒选择与鉴定参考文献8-11。1.2.3 LMG金标试纸条的制备 自制金标试纸条由样品垫、金标垫、硝酸纤维膜和样品吸收垫4个部分组成。先将LMG抗体配制成浓度12 mg/L，放入玻璃纤维素膜，浸泡后烘干，4 保存备用。在硝酸纤维素膜上用点膜机将LMG-卵清蛋白结合物(LMG-OVA)和羊抗兔IgG喷成2条线，分别为检测线和质控线，再用含1%BSA的PBS溶液封闭后真空干燥。将吸水纸，硝酸纤维膜，玻璃纤维膜，加样纸，依次粘于PVC背衬板上，裁成细条备用，试纸条检测原理同文献12。1.3 样品检测1.3.1 样品处理 取10 g剪碎的水产品于离心管中，加入20 mL乙酸乙酸，充分均质混匀。4 000 r/min离心10 min，取上清于50 水浴氮气吹干。在吹干样品中加入11环己烷-水溶液20 mL，漩涡震荡提取3 min，静置后取环己烷层，再加入0.8 mol/L的HCl溶液0.2 mL，漩涡震荡提取3 min后静置30 min。加入0.8 mL蒸馏水，混匀后于8 000 r/min离心10 min，弃去上层环己烷，吸取下层清液，再用0.8 mol/L的NaOH调整pH为6.08.0，最后用0.01 mol/L PBS缓冲液定容至10 mL待测。1.3.2 检测与结果判定 取样品提取液100 L，缓慢滴加于试纸条的玻璃纤维素膜上，将试纸条水平放置，5 min后观察结果。如试纸条硝酸纤维素膜上仅1条红色带出现则判定为阳性;如出现2条红色条带则为阴性;若质控线不出现红色条带，无论检测线是否出现，测试结果均无效。1.3.3 方法学指标的确定13-14 (1)最低检出限实验：本试验条检出限：指从目测看得见检测线至完全看不见检测线时的浓度为最低检出限15。将LMG标准品配置成160，80，40，20，10，5，0 g/L等系列浓度，观察各浓度显色情况，判断最低检出限。(2)重复性实验：配制LMG为0，20，100 g/L标准工作浓度，每个浓度分别用8条试纸条检测，观察各浓度显色情况，根据显色来判断试纸条的重复性。(3)稳定性实验：将试纸条放入37 环境下进行加速破坏性实验，每隔24 h测定1次，(37 下24 h相当于4 于45 d的破坏效果)，检测LMG标准溶液0，20，100 g/L观察试纸条显色情况，折算后确定试纸条保质期。(4)交叉反应实验：将孔雀石绿、结晶紫、氯霉素、副品红、甲基蓝、四环素等标准物质配制12 500，5 000，1 000，500，100，20，0 g/L系列浓度，用试纸条进行检测。根据下列公式计算各类似物对LMG金标试纸条的交叉反应率(CR%)。CR%=(LMG的最低检出限/其他物质的最低检出限)100%。1.4 GICA与ELISA法比对实验 从市场上采集10份水产品，经样品处理后分别用ELISA和GICA试纸条进行测定。设定100 g/L为阳性对照浓度，样品浓度高于100 g/L判断为阳性，低于100 g/L则判为阴性。根据检测结果计算GICA与ELISA方法的符合率。符合率(%)=(判定结果相同的样本数/总的样本数)100%。2 结 果2.1 胶体金颗粒选择与鉴定 结果显示，其颗粒大小对检测影响非常明显。本实验中确定的最低标记抗体蛋白量为10 mg/L，最适标记抗体蛋白量2 mg/L。2.2 检测指标 (1)最低出限(图1)：图1可见，本试纸条的最低检出限为20 g/L。(2)重复性：实验结果表明，在LMG浓度为0 g/L时，8条试纸均出现8条红色色带，显示为阴性结果;而在测定浓度为20和100 g/L LMG标准时，8条试纸只出现了1条红色色带，显示为阳性，表明试纸条重复性良好。(2)稳定性：该试纸条在37 环境下能稳定检测结果9 d，推算出试纸条在4 条件下可稳定保存12个月。(4)交叉反应率：结果显示，副品红、甲基蓝、四环素等物质未出现交叉反应现象，而孔雀石绿、结晶紫、氯霉素与试纸条有交叉反应，发生反应的最低浓度分别为100，5000和12 500 g/L，交叉反应率分别为20%，0.4%和0.16%。2.3 GICA与ELISA对比实验符合率 分别用ELISA测试盒与GICA试纸条对10份水产品加标后的样品提取液进行测定。结果显示，GICA检测出9份阳性样品，1份阴性样品，而ELISA试剂盒检测出10份阳性结果。根据符合率计算公式，可计算出GICA试纸条与ELISA试剂盒的符合率为90%，表明本试纸条具有很高的准确性，能够满足现场检测要求。3 小 结本试纸条融合了单克隆抗体、纳米金以及膜层析等高新技术，是金标免疫层技术的集成产品。胶体金颗粒的大小是试纸条质量高低的关键，可通过柠檬酸三钠的量来进行控制。柠檬酸三钠加入越多，获得胶体金颗粒直径越小，反之则胶体金颗粒越大。胶体金颗粒太小，结合蛋白量少，反应结合率低，另外难以显示明亮清晰的颜色，影响显色效果;胶体金颗粒过大，其结合蛋白质稳定性差，且难以通过膜孔径。本实验获得的胶体金粒直径为1520 nm，膜通过性好，稳定易保存，检测结果显色清晰易辨别。与薄层色谱(TLC)法、高效液相色谱(HPLC)法及ELISA法相比，GICA试纸条在进行LMG样品检测时不需要任何仪器，也不需要添加其他试剂，操作简便快捷，结果灵敏准确，检测成本低廉15 min内即可得到结果，真正实现一步法(ONE-STEP)检测11，尤其适合于基层现场快速检测，是检测水产品中无色孔雀石绿的有效方法。【参考文献】 1 Hernando MD,Mezcua M,Suarez JM，et al.Liquid chromatography with time of flight mass spectrometry simultaneous determination chemotherapeutant residues in salmonJ.Analytica Chimica Acta,2006,562:176-184.2 Commission Discussion 2002/676/EC.Implementing council directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results,2002,the commission of the European Communite.3 杨志俊.胶体金免疫层析法在卫生检疫医学实验中的应用J.中国国境卫生检疫杂志，2005，28(1)：23-25.4 Verheijen R,Osswald I K,Dietrich R,et al.Development of an one step strip test for the detection of (dihydro)streptomycin residues in raw milkJ.Food and Agricultural Immunology,2000,12(1):31-40.5 严华，申厚凤.胶体金免疫层析技术的应用与展望J.微生物学免疫学进展，2005，33(3)：86-90.6 贺昕，熊晓东，梁敬博，等.免疫检测用纳米胶体金的制备及粒径控制J.稀有金属，2005，29(4)：471-474.7 阳光秀兰，赵晓联，汤坚.单分散性体金的制备工艺优化J.免疫学，2004，20(2)：151-154.8 张明，吴国娟，沈红，等.免疫胶体金法检测磺胺甲噁唑残留的研究J.中国兽药杂志，2006，40(4)：17-19.9 Deng YP,Zhao HQ,Jiang L.Applications of nanogold particles in biomimetic engineeringJ.China Basic Sci,2000,9:1-17.10 陈小峰，刘曙照.胶体金标记免疫分析及其在小分子化合物快速检测中的应用J.药物生物技术，2004，11(4)：278-280.11 彭剑淳，刘晓达，丁晓萍.可见光光谱法评价胶体金粒径及其分布J.军事医学科学院院刊，2000，24(3)：11-12.12 魏文平，龚振明.胶体金免疫层析法检测兽药残留的原理和方法J.黑龙江畜牧兽医，2007，8：41-43.13 赵海峰，甘一如.胶体金免疫层析法检测小分子物质J.农药，2007，46(7)：439-443.14 赵晓联，龚燕，孙秀兰，等.金标免疫层析法检测黄曲霉毒素B1的方法J.粮油食品科技，2005，13(6)：48-51.15 Zhou P,Lu Y,Zhu H,et al.Nanocolloidal goldbased immun