响应面法优化提取三角帆蚌粗多糖及分离纯化和一级结构表征的研究.doc

响应面法优化提取三角帆蚌粗多糖及分离纯化和一级结构表征的研究摘要：本课题主要是对三角帆蚌多糖（HCPS）的提取、纯化和一级结构表征进行研究。首先，在单因素的基础上，采用三因素三水平Box-Behnken设计和响应面分析法优化提取三角帆蚌多糖（HCPS）。结果表明，最佳条件为：提取温度80, 提取时间4.5h，固液比为：1:8（v / w），在此条件下，粗多糖得率为3.66%。粗HCPS通过DEAE-cellulose 52色谱和Sephadex G-100色谱分离得到三种组分：HCPS-1, HCPS-2 和HCPS-3，各自的得率分别为HCPS-1 26.91% HCPS-2 30.18%为和HCPS-3 3.93%。通过傅里叶变换-红外光谱法，液相色谱方法和气相色谱法对进行结构研究，表明：HCPS-3与HCPS-1或HCPS-2相比结构上具有很大差异。关键词：优化；多糖；提取；纯化；三角帆蛙1 介绍从植物、附生菌和动物中提取的多糖包含物已经被广泛应用在传统中医药一些疾病的治疗方面。蚌类是生物多糖资源的一个研究热点。据报道，蚌类多糖具有潜在的生物功能，如：抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、抗氧化等等。因此，从各种各样的蚌类中发现和鉴定新多糖已经成为一个研究热点。在中国，三角帆蚌作为淡水珍珠贝家族的一员是最经济、最重要的贻贝种类。在世界市场上，95%的淡水贻贝来自于中国，而95%的淡水贻贝来自于三角帆蚌。在中国质量高的三角帆蚌被广泛的养殖。但是三角帆蚌下脚料（淡水贻贝生产废弃物）多被用于动物饲料和肥料当中。事实上，这些下脚料可以应用于食品和医药的原材料中。据报道，三角帆蚌在传统中医药中用于治疗一些疾病。另外，最近研究表明，三角帆蚌下脚料富含多糖，这些多糖具有营养和药理功能，如：抗肿瘤、增强免疫力、抗炎症和抗老化。但是，对于三角帆蚌多糖（HCPS）的提取、纯化、结构特征和生物活性的研究关注还少。因此，本研究详细报道了HCPS提取参数的优化和精制HCPS的一级特征。响应面法（RSM）被广泛应用于优化培养条件和发酵过程中的培养基组成，酶反应的条件和食品工业和制药工程的生产参数。RSM中的Box-Behnken(BBD)设计，仅有三个水平（低、中和高，编码为-1,0,+1）并且需要少数试验。与其他的试验方法比较，它是更有效的，更早的被用于安排和解释试验的一种方法。因此，RSM中的BBD用于优化当前的HCPS提取条件的研究工作中。首先在进行RSM试验之前进行单因素试验设计（提取温度，提取时间，提取次数，固液比），第二，在单因素的基础上选择三因素（提取温度，提取时间，固液比）三水平进一步优化，第三，HCPS通过阴离子交换色谱法和分子排阻色谱法进行纯化，并且单一组分通过傅里叶变换-红外线光谱（FT-IR），高效液相色谱（HPLC）和气相色谱法（GC）进行结构特征分析。2 材料和方法2.1 材料和试剂 三角帆蚌（中国 南京珍珠饲养场）；阿拉伯糖、鼠李糖、海藻糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、葡聚糖；DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100购自于Sigma化学公司，其他化学试剂均为分析纯。2.2 多糖的提取 HCPS是依照前人研究报道的方法基础上稍作改良进行提取的。即，收集新鲜的三角帆蚌并且用水仔细处理干净，去除贝壳，鲜肉用75%的乙醇浸泡备用。预处理的三角帆蚌鲜肉在高速匀浆机中绞碎，匀浆液用去离子水进行稀释（固液比为5:20），在6090的水浴锅中浸提25h，浸提之后，混合物在5000r/min离心15min，不溶性残渣重复以上步骤2-3次。收集上清液，经旋转蒸发仪浓缩到一定体积，浓缩液用三倍体积的无水乙醇混合（乙醇最终浓度为75%），在室温下静置24h。然后溶液在5000r/min离心15min，收集醇沉物作为粗提物。用去离子水溶解粗提物，利用Sevag法除蛋白10次，并用旋转蒸发浓缩和用无水乙醇醇沉（混合物最终浓度为90%）。最后，经过5000r/min,15min离心的沉淀物用去离子水溶解，冻干后获得天然产物。2.3 RSM试验设计在制备多糖的单因素试验基础上，选择合适范围的提取时间，提取温度和固液比，提取次数预先确定。利用三因素三水平BBD试验设计确定多糖生产的最佳提取参数。在单因素试验分析的基础上，选定提取时间、提取温度和固液比为变量参数，表1为BBD试验因素水平和响应值表。整个实验设计包含17组随机实验和五个在设计中心的重复试验（1317），用于估计平方和的纯误差，每组试验的响应值为重复试验的平均值。 在试验数据的的基础上，进行回归分析得到一个二次多项式模型：Y为响应变量，A0、Ai, Aii, Aij分别是截距、线性二次方程的系数， Xi, Xj分别是独立的变量（i=/j）。通过Design-export软件进行非线性回归分析，从每一组的实验设计中获得的二次多项式系数和响应受非线性回归倍数的影响。多项式方程的失拟度用R2表示，它的统计显著性用F-检验的P值0.001,0.01,0.05检验。回归系数的显著性也用F-检验。2.4 多糖的纯化 粗HCPS分别用DEAE-cellulose 52 和 a column of SephadexG-100进行纯化，其方法是在Bendahou等的方法基础上稍作修改。粗HCPS溶液（15mg/ml,3ml）注于DEAE-cellulose 52柱（2.6*30cm），然后，用0.0，.,0,0.3,0.5,0.7mol的氯化钠溶液在流速为60ml/h的条件下进行梯度洗脱，自动收集洗脱液（10ml/管）然后用苯酚硫酸法检测多糖的含量。结果获得三种多糖组分，浓缩，透析，进一步通过Sephadex G-100柱进行纯化，获得HCPS-1, HCPS-2 和HCPS-3。最终将HCPS-1, HCPS-2 和HCPS-3冻干做进一步研究。2.5 多糖结构特征分析通过MB154S型傅里叶变换红外光谱仪在500-4000cm-1范围进行KBr压片法得到多糖的FT-IR图谱。根据前人研究报道HCPS成分包含碳水化合物、蛋白质、糖醛酸和硫酸盐。在10mg/ml,25条件下用乌氏粘度计测量HCPS的粘度系数（相对于去离子水）, 采用气相色谱法(GC-6890N安捷伦)对HCPS的单糖组分进行分析,用火焰离子化检测器和HP-5毛细管柱(30米0.32 mm 0.25 lm)进行检测。气相色谱的操作条件如下: N2,H2和空气流速分别为25、30和400ml/min,温度、检测器、烘箱的入口温度分别是210,280和250。HCPS的相对分子量采用装备有一个TSK-GelG3000SWXL柱高效液相色谱仪测定(1100系列高效液相色谱，安捷伦)，用0.1 molNa2SO4和流速为0.8ml/min，在25的条件下进行洗脱，利用标准葡聚糖样品建立标准曲线以此来对样品进行测定。3 结果与讨论3.1 提取温度对HCPS得率的影响研究提取温度对HCPS得率的影响,采用不同的（60、70、80、90 ）提取温度（60、70、80、90 ）提取HCPS,而其他的提取参数符合如下要求:提取时间4h,料液比1:20，,提取次数为3次。如图1A所示, 从60到90 HCPS得率有一个递增趋势。这个趋势与其他多糖提取报道相符。统计分析表明,显著性差异在60，70和80之间以及在60,70和90(P 0.05）。这些结果表明,正面且显著之影响的萃取温度是当产量小于80 HCPS C,效果并不显著当萃取温度高于80。因此,80被选定为中心的点萃取温度实验和较高的温度会增加的能源浪费成本为提取工艺。表1Box-Behnken设计矩阵和反应收率的HCPS值。3.2 提取时间对HCPS收率的影响萃取时间是另一个因素,与流动相影响了提取效率。它已经广泛用于多糖的生产提取。另外,过长的萃取时间会引起多糖的分子结构的变化。 在目前的研究中,提取时间上影响HCPS收率已采用了不同的提取时间(2、3、4和5小时),而其他提取变量如下:提取温度80，料液比为20和提取3次。结果表明在随HCPS产量的增加而提高提取时间范围为2 - 4小时(图1 - 1B)。统计分析表明, 在2h、3h 、4h和2h、3h、5h (P 0.05) 其间差异不显著。 因此,萃取时间的4 - 5个小时有利于生产HCPS。为节约能源和降低成本,4小时被选定为最佳提取时间。3.3 料液比对原料收率的影响为了解不同的料液比对收率的影响，料液比设置分别为5、10、15、20，料液比5 20，5与10,5与15，5至20(P 0.05)如图所示（图1C），却无显著差异。料液比5-10 HCPS收率从1.20显著增加到2.98%。 这可能是多糖分子量的增加而导致的。因此,料液比10被定为最佳实验条件。3.4 提取次数对HCPS收率效果的影响图1D显示提取次数对收率的影响，其他的提取参数拟合如下:萃取温度80、提取时间4小时,和料液比20。图1D显示,在提取次数上存在一个增长点,但2倍和3倍之间没有显著性差异(P 0.05)。考虑到成本，提取的多糖,2次是足够的。因此,2次被选定为接下来的实验提取次数。3.5 预测模型和统计分析如表1所示，提取条件对应了一个相当大变化的产量。基于参数,取决于响应变量和测试变量之间的关系。通过运用多元回归分析方法对实验数据分析,预测反应收率可以指挥多糖的提取，同时运用下列二阶多项式方程:x1,x2、x3是变量,分别由提取变量、温度()、提取时间(h)和固液比来决定。回归方程的统计学的意义分别验算通过实验、方差分析的反应曲面二次多项式模型。对方差分析的二次回归模型进行论证表明该模型是非常重要。和费舍尔的梗非常高的模型F-value(114.74)和极低(P F”不到0.05,该模型是有意义的。据表2,所有的回归系数都有极显著意义,与x ,x 、x ,x,x，x ， x x ,x x ,x x 均显著的模型条件。3.6 反应曲面图和平面线图概括三维响应面和二维轮廓图回归方程，它们提供了实验中的两种测试变量之间相互作用的关系。轮廓图展示了圆形或椭圆形存在着显著性差异的相互关系。圆形轮廓图表明相应的相互作用之间可忽略,而椭圆轮廓图显示相应的变量之间的相互作用是有意义的,在目前的研究中,三个独立的响应曲面和各自的轮廓图如图2 .很清晰地, HCPS的收率有些小的改动测试变量(温度、时间和料液比)。此外,所有的测试变量的相互作用的发展具有十分重要的意义。通过这些三维响应面和各自的轮廓图,通过表2中两个变量和它们的最佳状态可以非常简单和方便的了解两变数间的相互作用。通过分析 (图2)、最佳的条件得到HCPS量近似3.54%以下范围为最佳条件:萃取温度77.12-84.17,提取时间3.97-4.65 h，料液比5.00-10.16。 从上述的分析中,最佳的HCPS产量出现在较低的料液比(图2D与图2F),合适的萃取温度(图2B和图d)和很长的提取时间(图2B和图2F)。3.7 最佳的提取参数和模型的确定通过使用软件,最佳的试验变量被确定，萃取温度79.85、提取时间4.46 h和料液比8.08。通过优化条件的分析,最大限度地测定HCPS的产量是3.74%,略优于其他两种材料,通过细节分析，考虑到操作便利、最优的参数的分析确定如下:温度80,时间4.5小时和料液比为8。利用这些参数,预测HCPS的产量大概是3.73%,比预期值的最大值略少。为了验证模型方程的充分性,在众多的试验条件中5个试验研究被选中 (在实验浮动范围内)。在最优提取变量中最为合适的在五个实验中的这些条件下被确定:萃取温度80、提取时间4.5 h和料液比8。表3显示了随着实验的设计矩阵预测结果和理论值之间的回归方程。与实验和理论的相关系数(R)是0.9823。实验和预测值间的有效水平为0.05在统计学上是可以忽略的。结果表明,问题是一致的,并预测回归模型对HCPS的提取是准确和适当的。表2两个相关变量的变化率的估计与其二次多项式模型试验的意义Fig. 2.反应曲面图（A、C和E）与轮廓图（B、D 和F）展示了提取温度(X1)，提取时间(X2)和料液比(X3)对HCPS提取量得影响。表3模型验证实验3.8 HCPS的净化和结构表征粗糖分离的解决方案首先是通过一种离子交换色谱柱DEAE-cellulose 52,这两次离子交换提供三个独立的洗脱峰(F1,F2和F3)，由苯酚-硫酸分析法(图3A)测得。三个收集样进一步用Sephadex G-100柱纯化，流动相为水。 作为结果,每一个单独的洗脱峰产生的一小部分。3B-D(图), 分别命名作为HCPS-1 HCPS-2和HCPS-3。HCPS-1 HCPS-2和HCPS-3是粗糖的获得率,分别为26.91%,30.18%，3.93%。粗糖HCPS及纯化后的糖通过高效液相色谱、气相色谱、红外光谱进行分析其初步特征。表4显示了粗糖HCPS,HCPS-1,HCPS-2和HCPS-3的相对粘度(去离子水),相对分子量、糖、蛋白质、根酸和硫酸盐。 我们发现HCPS-3大不相同于HCPS,HCPS-1和HCPS-2。 HCPS-3包含9.42%的蛋白质,这意味着它将可能是蛋白。此外,HCPS-3硫酸盐含量和相对粘度较高。对HCPS的单糖组分进行了分析。粗糖的组成,其侧链是鼠李糖，阿拉伯四聚糖,海藻糖,甘露糖,葡萄糖和乳糖，其摩尔比为5.71:2.21:1.69:3.40:82.21:4.78。 只有HCPS-1组成其侧链是阿拉伯四聚糖和葡萄糖其摩尔比值为2.12:97.88。HCPS-2仅仅是由葡萄糖组成。HCPS-3由鼠李糖,海藻糖、甘露糖、葡萄糖和乳糖组成的其摩尔比为13.80:4.51:7.70:64.92:9.07。 这些结果表明,由单糖组成的HCPS-3比HCPS-1或HCPS-2的更复杂。Fig. 3.HCPS经过新型阴离子交换色谱柱DEAE-Cellulose 52两次离子交换得到洗脱曲线 (A)和经过色谱柱Sephadex 52(B-D G-100) 两次离子交换得到洗脱曲线的多糖组分(F1,F2和F3)。表格4粗糖HCPS, HCPS-1, HCPS-2 and HCPS-3的表面特征图4红外光谱法对HCPS-1 (a), HCPS-3 (b), crude HCPS (c), and HCPS-2 (d)的扫描如图4中所表现的一样，特色鲜明的两个吸收峰的多糖,在3100-3700 cm-1处有一个大的吸收光谱带，在2800 -3000