利用基因重组技术生产制备人生长激素.doc

利用基因重组技术生产制备人生长激素08药学 毛友枚指导老师 王晓利一、人生长激素的临床应用人生长激素（human Growth Hormone hGH）是脑垂体前叶分泌的一种蛋白质。由191个氨基酸组成的多肽，其基本功能是能促进蛋白质的合成、促进骨骺软骨细胞增殖和长骨的生长、促进肝糖原分解、减少对葡萄糖的利用、促进脂肪组织分解，从而促进人体各种组织细胞增大和增殖，使骨骼、肌肉和各系统器官生长发育，即促进生长及与其他激素共同控制新陈代谢。生长激素是刺激线性或纵向生长的主要激素，在矮小症治疗方面表现为促进肌肉组织增加，身高增长，近年来随着临床研究的深入，发现生长激素具有广泛的生理作用，临床应用日趋广泛。目前应用主要有以下两个：（一）大手术和烧伤上的应用生长激素不仅具有促进生长,而且可影响代谢过程, GH 能够在病人应激状态下，增加肌肉及肝脏对氨基酸摄取和蛋白质合成,促进脂肪分解,代替蛋白质氧化供能。GH 尚有加速伤口愈合,刺激成纤维细胞分裂和胶原形成。GH亦能刺激巨噬细胞分化成熟,加强抗感染能力。大手术和烧伤病人均处于高度应激状态,分解代谢增强,能量大量消耗,出现明显负氮平衡1。在一般常规给予葡萄糖、脂肪乳剂和多种氨基酸治疗常无法在较短时间内完全逆转,必须药物来调节代谢水平。应用GH 后免疫球蛋白含量较术前稍有提高,而且伤口感染率低。GH 在烧伤病人中应用除蛋白质合成升高外,尚见到游离脂肪酸浓度增高。伤口愈合加快,一般可提早2d。（二）治疗充血性心力衰竭生长激素在维持正常心血管生理功能中具有重要的作用，它可以直接或间接地通过胰岛素生长因子21 (Insulin Growth Factor21 IGF21) 而发挥作用,能调节心室的结构和功能。此外，hGH 还可应用于短小肠综合征, 改善肌体对肠内营养物的耐受性, 刺激术后小肠的重生长; 应用于成人肥胖症, 增加熔脂储氮, 在不用严格限制饮食的同时保存蛋白质及肌肉, 避免了其他减肥药易致体虚及电解质紊乱; 提高慢性肾功能衰竭患儿的生存质量, 改善终身高2。二.人生长激素的开发背景人生长激素提取并试用于儿童侏儒症始于1958年。后经各国不断改进产品纯度和进行临床试验，遂在确认临床有效后自1975年起逐步在各国正式获准临床应用。然因提取的人生长激素来于死人脑垂体，临床用量难以保证,而时人生长激素的结构已经得到解析，因此人们开始研究应用化学合成和基因重组方法生产人生长激素。其中前法效率甚低，并无实用价值，但后法却在美国Genentech公司等的努力下于1981年实现了工业化。 Genentech公司生产的基因重组人生长激素因方法问题，其结构与天然人生长激素不完全一致，它较后者在N末端多了一个甲硫氨酸基，所以也称甲硫氨酸基（蛋氨酸）人生长激素。该产品一般名为somatrem，其用于人体可使70%患者出现抗人生长激素抗体，它已在临床试验中被证明与提取的人生长激素生理活性完全相同。 为有效降低somatrem用药导致出现高比例抗体问题，美国Lilly公司和丹麦Novo Nordisk公司等又继续致力于基因重组人生长激素生产的工艺技术研究，结果先后开发出结构与人生长激素完全一致的基因重组人生长激素。这些与人生长激素结构完全一致的基因重组人生长激素已被临床证明其生理活性与提取的人生长激素基本相当，而抗生长激素抗体却几乎不再出现。现它们已在世界各国销售，而目前临床所用的最主要的人生长激素也正是这类基因重组人生长激素。三.基因重组技术基因重组技术是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种、生产新产品。从复杂的生物细胞基因组中,经过酶切消化或PCR 扩增等步骤, 分离出带有目的基因的DNA 片段, 取得所需的基因(外源性DNA 片段); )； 或者从特定细胞里提取所需基因的mRNA 后, 在适宜的条件下利用逆转录酶的作用来取得所需基因; 或者通过探明目的基因所含的遗传密码及其排列顺序.。然后用化学方法人工合成所需的基因。基因运载体是具有自体复制能力的另一种DNA 分子, 其经过处理后能与外来基因(外源性DNA)相结合, 并带有必要的标记基因。常用的基因运载体主要有两类: 一类是质粒, 另一类是病毒(包括噬菌体)。以前者为例, 首先用溶菌酶分解细菌细胞壁, 然后用物理化学的方法, 把质粒与其他成分分开, 从而得到纯粹的质粒。通过专一限制性内切核酸酶的处理或人为的方法, 使带有目的基因的外源DNA 片段和能够自我复制并具有选择标记的载体DNA 分子, 产生互补的粘性末端而相互配对结合, 并通过连接酶在体外使两者连接起来, 形成一个完整的新的重组DNA 分子。然后用人工的方法(转化或转导法) 将重组DNA 分子转移到适当的受体细胞(宿主细胞)中,使其能在细胞中复制和增殖, 形成重组DNA 的无性繁殖系(即克隆), 从而扩增产生大量特定目的基因, 并使之得到表达, 即能指导蛋白质的合成。最后从大量菌中设法筛选出带有目的基因的重组菌(克隆株系), 并进行鉴定。然后培养克隆株系, 提取出重组质粒, 分离已经得到扩增的目的基因, 再分析测定其基因顺序。将目的基因克隆到表达载体上, 再次导人到受体菌中, 经反复筛选、鉴定和分析测定, 最终获得较稳定的高产的基因工程菌, 然后进行大量培养繁殖, 产生出所需要的目的基因产物, 再进行分离纯化。图1 基因重组过程图3四.利用基因工程技术生产人生长激素的工艺流程酶切pGH4,pXMT,pSV2neo重组限制性DNA片段转化pSMG1和pSMG2hGH成品筛选克隆化分离鉴定转化混合物基因工程细胞扩大培养阳性转化体hGH精品hGH粗品培养液分离精制纯化浓缩、冻干图2 人生长激素制备工艺路线图五.用基因工程技术生产人生长激素的工艺过程(一)重组质粒的构建1将质粒 pGH4 先用EcoRI进行切割，产生2个线性片段，然后再用BamHI酶切，用琼脂糖凝胶电泳进行片段分离，并用标准分子质量DNA片段作对照，回收2.1kb的DNA片段，即得hGH目的基因片段同样用EcoRI先酶切质粒pXMT，得到1个线性片段，然后再用Bgl酶切产生2个限制性片段，用琼脂糖凝胶电泳进行片段分离，并用标准分子质量DNA片段作对照，回收0.7kb的DNA片段，即得含金属硫蛋白（Metallothionein MT）启动子的DNA片段PSV2neo是一个载体DNA，将其用酶切即得线性载体分子。将上述得到的2.1、0.7kb和线性载体3个DNA线性片段混合，加含ATP的TEN缓冲液，再加入T4-DNA连接酶，混匀，12.5反应连接1824h，反应完成后于65加热 10min，再置冰浴降温，得重组质粒pSMGH混合物。因为BamHI和Bgl为同尾酶，因此这两个酶进行酶切后的黏性末端能够配对连接，然后再与线性载体连接，由于金属硫蛋白（MT）启动子基因能以不同插入方向 连接，故可得到pSMGH1和pSMGH2两种重组质粒混合物，将连接混合物于4对含50mmol/LCaCl2的Ph8PH8.0，10mmol/LTris-Hcl缓冲液透析45h，即可用于细胞转化。（二）细胞转化取小鼠 TKL细胞用F-10培养基制成细胞悬浮液，接种于培养瓶中，培养基中含10%小牛血清的F-10，于37培养箱通5%CO2 的洁净空气培养3d,细胞贴形成单层后，加入含 pSMGH1和pSMGH2两种重组质粒混合溶液，混匀后加无菌CaCl2溶液至终浓度为50mmol/L，混匀，于37保温3040min，或于4过夜，然后加入等体积含3%小牛血清的DEME培养液培养12h，吸除培养液，加25%DMSO（）于培养瓶中，室温下处理2min，吸去DMSO，用F-10培养液洗涤后培养24h，胰蛋白酶消化分散，按1：4分种率扩大培养成单层细胞(三)转化体筛选鉴定 当上述细胞转化混合物培养成致密单层后，除去培养液，加胰蛋白酶消化分散，制成细胞悬浮液后接种到含10%小牛血清、HAT（H次黄嘌呤Hypoxantin 15ug/mL，A氨基蝶呤Aminopterin 1ug/mL，T胸腺嘧啶脱氧核苷Thymidin 5ug/mL）及100U/mL青霉素和链霉素的F-10培养液中，于37培养，此后每3d换一次新鲜培养液，直至出现转化细胞集落，用细胞集落分离器分别取出转化的单株细胞，或者采用有限稀释法及96孔微孔培养板进行克隆化培养和筛选，并通过放射免疫法测定hGH的表达和分泌效果，直至选出高效表达的单克隆基因工程细胞，进行逐级扩大培养，并将培养基中小牛血清浓度逐步递减至2.5% （四）基因工程细胞大规模培养 将扩大培养后的基因工程细胞单层用胰蛋白酶常规消化分散后，按1：4的分种率或5104个/mL细胞的接种量接种于5L转瓶中，培养基为含2.5%小牛血清、1umol/LCaCl2，及100U/mL青霉素和链霉素的F-10培养液，或无血清培养液，于37旋转培养4d，取出培养液用于分离hGH，再向转瓶中添加新鲜培养液继续培养和收集培养液。如此反复多次培养和收集培养液，可用于分离hGH.(五)hGH的分离取10L上述细胞培养液，滤清，滤液用50%醋酸调pH至5.0，5搅拌1h，4 000r/min离心20min，弃去沉淀。上清液用1mol/L溶液调pH8.5，用分子质量截留值10 000D的超滤膜，0.1mol/LTris-HCl(pH8.5)缓冲液洗涤超滤浓缩5倍。于5下加冷乙醇，5放置过夜，次日倾出上清液，下层悬浮液于4000r/min离心10min，收集沉淀，沉淀用3倍体积（/L）丙酮洗涤3次，真空干燥。按每克干粉用50 mL 0.1mol/LNaOH溶液于5下搅拌抽提2h，立即用5mol/LHCl溶液调pH至10.5，4000r/min离心10min，除去沉淀，上层液滤清，超滤浓缩得hGH抽提液（六）GH精制纯化和冻干取SephadexG-100柱，用PphH9.0,0.01mol/LTris-HCl缓冲液平衡，然后将上述hGH溶液上柱进行凝胶过滤层析，再用平衡缓冲液以同样流速洗涤和洗脱，按体积分部收集，合并含hGH洗脱液。另取DEAE-Sepharose柱，用pH8.5、0.01mol/LTris-HCl缓冲液平衡。另将上述含hGH的洗脱液用5mol/LHCl溶液调至pH8.5、然后上样DEAE-Sepharose柱进行离子交换层析，先用平衡缓冲液洗柱，再用含0.06mol/LNaCl的Ph8.5,0.01mol/LTris-HCl溶液及含1mol/LNaCl的PH8.5,0.01mol/LTris-HCl溶液进行梯度洗脱，并按体积分部收集，合并含hGH洗脱液。用分子质量截留值10000D的超滤膜超滤洗涤脱盐并浓缩，然后用1mol/L醋酸调pH至5.6。另将CMC（CM23）柱用含1%正丁醇的pH5.6，0.01mol/L醋酸铵缓冲液平衡后，将含hGH的pH5.6溶液上柱进行离子交换层析，并用Ph5.6,0.05mol/L醋酸铵溶液洗柱，再用含0.2mol/LNaCl的醋酸缓冲液及含1mol/LNaCl的醋酸缓冲液以同样速度进行梯度洗脱，并按体积分部收集，合并含hGH的洗脱液，用分子质量截留值10000D的超滤膜超滤浓缩和洗涤，得hGH精品，分装、冻干后即得hGH成品4。得到的原料药半成品可以在-20下长期存放。 综上所述，过去rhGH仅用于对儿童的促生长。而且垂体来源困难，价格昂贵。使生长激素的治疗应用和研究深受限制。随着基因工程重组人生长( rhGH) 的开发应用,使rhGH 在治疗上有突破进展, 其效应可作用于全身各系统的靶组织。虽然基因重组技术生产人生长激素生产过