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食品微生物检测基础姜珊珊 食品微生物简介P148 微生物的概念 微生物包括的种类 病原微生物的概念 微生物的特性 细菌的基本形态和结构 微生物的定义 是一群形体细小 结构简单 人肉眼看不见 必须借助于光学显微镜 电子显微镜放大几百倍 几千倍甚至几万倍才能看到的生物 微生物包括细菌 放线菌 酵母菌 霉菌 螺旋菌 立克次氏体 衣原体 病毒及微藻类等 病原微生物定义 大部分微生物是有益的 只有小部分微生物是有害的 可以引起各种疫病 这部分微生物叫做病原微生物 微生物的特性 1个体微小 结构简单2分布广 种类多3繁殖快 数量大4易于变异 适应力强5易于培养 代谢活力强 细菌的基本形态和结构 细菌是一种具有细胞壁的单细胞生物 细菌的大小以微米 m 为测量单位 一微米等于千分之一毫米 根据细菌形态一般分为球菌 杆菌 螺旋菌三大类 细菌具有细胞壁 细胞膜 细胞质 细胞核 核糖体和内含物等基本结构 5细菌的特殊结构有荚膜 鞭毛 菌毛 芽孢等 6细菌的繁殖方式为无性的二分裂法 一般20分钟分裂一次 即为一代 7细菌的生长曲线分为四个时期有 迟缓期 对数生长期 稳定期 衰退期 1 迟缓期 此期细菌细胞增大 2 对数生长期 细菌总数与活菌数大致相等 3 稳定期 细菌繁殖速度逐渐减慢 此期细菌的增加数和死亡数几乎相等 4 衰退期 本期细菌死亡数大于增殖数 活菌减少 出现菌体变形 自溶等现象 细菌总数下降 食品微生物检测所涉及的类群 见GB4789 1 2010食品安全国家标准食品微生物学检验总则 菌落总数的测定 首先要明白菌落的定义 菌落的定义 将细菌划线接种在固体培养基上经18 24小时培养 长出肉眼可见的有单一细菌生长繁殖而成的细菌集团 见GB4789 2 2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 菌落总数的计算方法N C n1 0 1n2 d 例 0 10 012353340035n1 1n2 2N 235 33 35 1 0 1 2 10 1 菌落总数的报告例 0 10 01报出值0 0 101 0 102 0 103 2 25原液0 1报出值0 0 11 0 12 0 13 2 3 霉菌和酵母菌的计数 见GB4789 15 2010食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数 菌落计数及报告 1 选择菌落数在10 150之间的平板进行菌落计数 2 其他同菌落总数一样 注意事项 1 培养温度是在25 28 培养时间是5天 2 在往平皿中加培养基时应多加一些 当培养基自然漫过平皿底部时再多加一点 大肠菌群的测定 见GB4789 3 2010食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数 试样加入量 9支管 三个稀释度 液体 33 3mL 前三支 第一稀释度 加原液各10mL中间三只 第二稀释度 加原液各1mL后三只 第三稀释度 加1 10的稀释液各1mL固体 3 33g 前三支 第一稀释度 加1 10的稀释液各10mL中间三只 第二稀释度 加1 10的稀释液各1mL后三只 第三稀释度 加1 100的稀释液各1mL 查附录B表 报告结果例如 液体九只管均为阴性结果为 0 03MPN mL或 3MPN 100mL固体九只管均为阴性结果为 0 3MPN g或 30MPN 100g 实验室生物安全基本知识 第一节微生物实验室玻璃器皿的准备P161 一 洗涤载玻片和盖玻片在清洗前可先在2 盐酸溶液中浸泡1h 二 灭菌前的准备制作棉塞包扎器皿灭菌 第二节微生物培养基的制备P162 培养基的定义 是根据细菌的生长需要人工配置的营养环境 按物理性状分类可分为液体 半固体 固体培养基 按用途分类可分为基础培养基 营养培养基 选择培养基 鉴别培养基 厌氧培养基 第三节消毒与灭菌P163 一 干热灭菌法1 火焰灭菌 酒精灯 2 干热灭菌 电热干燥箱 二 湿热灭菌法1 煮沸消毒2 流通蒸汽灭菌3 巴氏消毒4 加热蒸汽灭菌法 高压灭菌锅 消毒灭菌的基本概念 1 灭菌 杀灭物体中所有微生物的繁殖体和芽胞的方法 2 消毒 杀死病原微生物的方法 3 防腐 防止或阻止微生物生长繁殖的方法 4 无菌 不含有活的微生物的意思 5 无菌技术 无菌操作 防止微生物进入机体或物体的方法 第四节无菌操作原则P164实验室安全及防护 检验室规则1 进入检验室必须穿好工作服 戴上工作帽 必要时可戴口罩及手套 工作完毕后离开检验室 脱去工作服 要放在指定地点 工作服要经常洗涤和消毒 2 检验室要经常保持清洁 整齐 禁止饮食 吸烟及用嘴湿润铅笔或标签等物 3 在检验室进行工作时 严禁喧哗 打闹 保持肃静 不得到处走动 以免影响他人工作 4 在检验中应确保无菌操作 以达到结果正确 未经许可不准将细菌及病料携带出室外 一定要妥善保管和处理好细菌和病料 5 各项仪器要精心爱护 贵重仪器要专人负责 定期检查与保养 使用时按照规定方法使用 6 检验室内各种培养基 试剂 染液等 必须贴上标签 写明名称 规格 配置时间等 不需要的培养物 应立即进行高压蒸汽灭菌处理 7 经常注意节约水 电 染色液及药品等 在离开检验室时 必须做好防护检查工作 特别是水 电 煤气的检查 8 工作完毕 检验台应及时清理 桌面用消毒液擦拭干净 用过的培养物 病料 动物及器具均须放在指定地点 不得随意乱放或用水冲洗 待灭菌后处理 9 离开检验室时 将用过的物品整理就绪 脱去工作服 将双手用消毒液浸泡3 5分钟 用肥皂水洗涤干净 方可离开检验室 显微镜的构造 A 机械部分 显微镜的机械装置是显微镜的重要组成部分 机械装置的作用是固定及调节光学镜头 固定与移动标本等 只有良好的机械装置 显微镜才能充分发挥作用 显微镜的机械装置由各种精密零件组成 1 镜座 它是显微镜的底座 一般为马蹄形 作用是支撑整个显微镜 有的显微镜座内装有照明光源和反射镜 2 镜柱 联系于镜座和镜臂之间 有支持显微镜其他部分的作用 3 镜臂 一般为弯柄形 拿取显微镜时握此臂 镜臂与镜柱之间有关节相连 可以作适当的倾斜 以便观察 有些显微镜的镜臂与镜柱之间没有关系 不能做任何角度的倾斜 镜臂有持镜筒 镜台 照明装置及调节焦距装置等作用 4 调节器 为了得到清晰的物象 必须调节物镜和标本之间的距离 使它与物镜的工作距离相等 这种操作叫做调焦 在镜臂上方 各镜位置不一样 有的一个在上方 一个在下方 有大小两种螺旋 一般向前方转动时 镜筒下降 向后方转动时镜筒上升 但也有显微镜 转动时镜柱下降 也有些显微镜在转动螺旋时 镜筒不变 而镜台上下升降 大螺旋 粗调节 可使镜筒作较大距离和较快速度的上升或下降 通常在使用低倍镜时 用大螺旋调节 能迅速找到物景 小螺旋 细调节 可使镜筒缓慢地上升或下降 可以作精细的调节 使物象更加清晰 此外 在镜柱附近还有一个聚光镜螺旋 可以使聚光镜上升或下降 5 镜筒 镜筒是由金属制成的圆筒 上端放置目镜 下端连接物镜 镜筒内壁 为了避免光线的乱反射 喷上黑色无光漆 筒长度一般为155 250毫米 常用的为160或170毫米 国产显微镜通常是160毫米 6 物镜转换器 回转盘 固定在镜筒下端 它有3 4个物镜螺旋口 呈盘状 根据需要放大倍数不同 可调换不同放大倍数的物镜镜头 7 载物台 也叫工作台或镜台 它的作用是安放载玻片 载物台中心有一个通光孔 通光孔后方左右侧各有一个安装片夹用的小孔 载物台由上下两片组成 上面一片装有旋钮 可向左右移动 下面一片通过旋钮可使上面一片前后移动 载物台的纵横坐标都装有游标尺 既能固定标本 又能使之前后移动 以便寻找物象 B 光学部分 1 目镜 因为它靠近观察者的眼睛 因此也叫接目镜 目镜安装在镜筒的上端 各种目镜的口径尺寸都是统一的 根据需要可以互换使用 目镜只起放大的作用 并不增强显微镜的分辨力 一般有2 4个 放大功率各不相同 镜的圆筒上面刻有放大率 如5 7 10 15 等符号可以区别 数字越大 放大率越高 使用时可根据需要 2 物镜 因为它靠近被观察的物体 标本 因此也叫接物镜 许多使用者在口语上把物镜和目镜都通俗地叫做镜头 物镜安装在镜筒的下端 它的作用是将标本第一次放大 然后再由目镜将第一次放大的象做第二次放大 物镜是决定显微镜性能的最重要部位 一般有2 4个 放大率也各不相同 镜的圆筒上面有放大率如4 或10 低倍镜 45 高倍境 100 油镜 等符号 有些显微镜的物镜上还刻有镜口率 如0 3 0 5 1 25等符号 这些符号的数字越大 放大率越高 一般计算显微镜的放大倍数是 目镜的放大率 物镜的放大率 显微镜的放大倍数 例如 目镜的放大率为10 物镜的放大率为45 这时显微镜的放大倍数为450 3 聚光器 是由一片或数片透镜组成 其作用相当于凸透镜 起聚光线作用 装在镜台下面 这样就能增强标本的照明 同时能使光线射入整个物镜镜口角 为了充分发挥显微镜的性能 在使用时聚光镜和物镜两者的数值孔径应相一致 在使用高倍境时 必须配以聚光镜 并且要求聚光镜和物镜口率一致 效果最好 聚光镜的镜口率可用光圈来调节 有些显微镜的光圈上刻有口径的记号 使用某种高倍境时 只有对准相应刻度即可 4 光圈 也叫可变光圈 位于聚光镜下方 由十几张金属薄片组成 中心部分形成圆孔 推动光圈的把手 可以随意调节圆孔的大小 有的光圈的边框上还刻有标明圆孔直径的尺寸 5 反光镜 反光镜通常一面是平面镜 另一面是凹面镜 装在聚光镜下面的镜座上 可以水平与垂直两个方向任意旋转 反光镜的作用是使光源发出的光线或天然光射向聚光器 在自然光线下 常用平面镜 在室内日光灯下 常用凹面镜 革兰氏染色 第一步 制片在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水 用接种环进行无菌操作 挑取培养物少许 置载玻片的水滴中 与水混合做成悬液并涂成直径为1厘米的薄层 若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液 则直接涂布于载玻片上即可 第二步 自然干燥第三