高效液相色谱质谱联用测定深海鱼油中DHA含量.doc

高效液相色谱/质谱联用测定鱼油中DHA含量深海鱼油因富含EPA (20：5)和DHA(22：6)等-3类的多不饱和脂肪酸而极具营养保健和临床医学价值。近二十余年的医学和营养学研究表明:EPA，DHA具有调节免疫,增强记忆,改善神经传导的功能和预防中风、心肌梗塞和动脉硬化的作用,并且是婴幼儿大脑发育所必须的物质。DHA常用的检测方法有气相色谱法和液相色谱法。气相色谱法在测定前需进行衍生化,但DHA属于长链的多不饱和脂肪酸,不易气化,需要较高温度条件;而当前报道的液相色谱的检测方法也都要经过衍生化处理。这些方法由于测定步骤多,在长时间的处理过程中极易带来DHA的同分异构化及多不饱和键的氧化;同时,由于鱼油中成分非常复杂,杂质峰干扰较大,给DHA含量的准确测定带来了困难。而采用高效液相色谱/质谱联用的方法测定鱼油及其制品中的DHA含量,具有流动相简单,分析时间短,且不需要对样品进行衍生,操作简便,定量准确,重现性好。所建立方法的优点是质谱分析不受色谱分离时间的限制并可实现对样品的重复分析。1、 试验部分（1） 仪器与试剂液相色谱仪(配有自动进样器)，质谱检测器(配有电喷雾电离源, ESI)DHA标准品，鱼油样品，甲醇为色谱纯试剂,其余试剂均为分析纯。（2） 液相色谱/质谱条件表1：液相色谱条件 色谱柱柱温()流动相流速( mL/min)进样体积（uL）C8柱21150 mm .i d(填料粒度5um)35甲醇:水(80:20)0. 35 表二： 质谱条件离子源 m /z范围（amu）毛细管电压（kV）锥孔电压（V）萃取电压（V） ESI电离源,电喷雾离子化负离子采集模式(ESI-)200800 3. 5 254.0射频电压（V）源温度（ ）脱溶剂温度（ ）脱溶剂气（L/h）选择离子（m /z）0.5103300280269，301，27（3） 标准曲线的制作 精密称取DHA标准品于10 mL容量瓶中,甲醇定容,得标准品的混合储备液。精密吸取不同体积的标准溶液,加入相同体积的内标物溶液,适量稀释至最终浓度DHA为0. 90, 1. 80, 3. 60, 5. 40, 7. 20, 9. 00ug/mL的标准系列溶液。HPLC-ESI/MS测定,以待测物与内标的峰面积比为纵坐标,待测物浓度为横坐标进行回归分析,得到标准曲线。（4） 样品处理2 g的鱼油样品,加入50 mL NaOH乙醇水溶液(2 M),充氮保护, 65回流1 h,加入10 mL蒸馏水和20 mL正己烷萃取未皂化物2次,水化层用3 M的HCl 10 mL酸化,正己烷20 mL3萃取水解出的游离多不饱和脂肪酸,过无水Na2SO4 40旋转蒸发溶剂,甲醇定容置棕色容量瓶,直接进高效液相色谱/质谱仪检测。2、 讨论与结果分析（1） 内标物的选择为了消除仪器不稳定及进样误差,对样品进行定量必须引入内标,这种内标必须是目标物中没有的组分并与目标物具有尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征,且能与目标组分充分分离。在通过对试验所用鱼油样品的成分分析及比较选择后,选用十七酸C17: 0作为内标物。（2） 分离条件的选择鱼油中含有多种性质相近的多不饱和脂肪酸,很难用常规的方法分离,由于与LC相连的是高选择性高灵敏度的MS,即使液相没有分离,对鱼油样品中的EPA/DHA的选择离子进行监测,也能准确定性定量。选用不同的分析柱,改变不同的流动相配比，选择较佳的快速分离条件。试验表明：当甲醇：水为80：20,梯度洗脱15 m in到100：0时,鱼油样品中DHA之间及其与内标物间达到理想的基线分离。（3） 质谱条件的优化为得到最佳质谱响应,提高其灵敏度,利用流动注射法(flow injection analysis, FIA)对其质谱参数进行优化。所测目标组分为脂肪酸,结构中有-COOH,在负离子模式下有较好响应。根据各参数对其响应和裂解方式的影响情况,主要对锥孔电压进行调节。试验中发现锥孔电压在30 V时,响应达到最大值,超过30 V,其响应信号反而减小,碎片离子增加。适量调节其他质谱条件,进一步优化。最后确定质谱条件参数见表二。（4） 质谱分析（5） 线性关系、检测限和定量限对加有内标的一系列浓度的标准溶液进样检测,每个浓度的试样平行分析3次,用所得峰面积比的平均值对浓度作曲线,得到DHA的标准曲线和线性范围。将标准溶液逐级稀释后,得到DH