胚胎植入前遗传学诊断的失误及改进.docx

胚胎植入前遗传学诊断的失误及改进朱前勇综述颜建华审校20世纪90年代初以来，随着分子生物学技术的日益完善，胚胎植入前遗传学诊断(preim plantation genetic diagnosis，PGD)的发展十分迅速，临床上可以鉴定性别，诊断多种单 基因病及染色体病，全世界已有近百例婴儿经PGD后诞生。但临床上PGD仍存在20%左右的误 诊率1，主要在于微活检技术的有效性不足和PGD常用的两种分析方法，即聚合酶 链反应(PCR)和荧光原位杂交(FISH)在利用单细胞做底物时存在着缺陷。许多学者针对这些 原因开展了一些新的方法，本文就PGD的误诊原因及改进作一综述。1显微活检技术的有效性PGD无论从卵细胞的极体还是从卵裂球中取材，都需要运用微活检技术，这是PGD技术的一 个难点。Reubinoff2报道：28%的卵细胞由于活检操作失误而不能用于PGD，原因 在于分离紧密连接的卵裂球能损伤细胞膜。Shee3把常规活检时分别用来固定囊 胚、酸溶透明带、抽吸卵裂球的3个吸管，减少为用2个，1个仍固定囊胚，另1个先用酸溶蚀 透明带，然后把酸吸回再抽出卵裂球。这大大缩短了活检时间，且在透明带上溶开的孔径与 吸管直径相同但略小于卵裂球的直径，从而避免活检后细胞质流出和细胞膜破裂。该法使活 检的有效性提高了10%3。另外，Cieslak报道新开展的三维透明带部 分切开术用于卵裂球活检，是在透明带上做一个V形切开(交叉裂口)，造成一个三角边口， 足够微吸管进入胚胎取出裂殖细胞。行胚胎活检时，转动胚胎直至V形切口置于3点处，固定 胚胎，微管进入焦距，施少许压力向上压开三角形叶片即插入胚胎，能在不扭曲胚胎卵裂球 外形下吸出裂殖细胞，三角叶片在微管离去后复位，在移植过程中可保护胚胎。该术不同于 用微针在透明带上造一裂口的传统方法，是一种安全、简单、有效的机械性透明带部分切开 造口术。Markus用激光在透明带上打孔但尚未用于人胚检查。总之，如何提高显微活检技术 的准确性及有效性还需进一步研究。2如何避免PCR中等位基因的缺失及提高PCR的效率1985年PCR技术建立后，Handyside于1990年首先应用于临床PGD，1994年Ray利用单细胞底 物以PCR诊断囊性纤维病(CF)时，发现了等位基因的缺失现象(allele drop-out，ADO)，即 ：以单细胞底物诊断单基因缺陷病时，如在杂合子的单细胞中，两个等位基因之一未被扩增 。这是导致PGD误诊的主要原因。ADO在理论上由Navidi和Arnheim在1991年提出，1994年才 在临床上引起足够重视。Grifo在1994年、Verlinsky在1996年相继报道过ADO导致误诊的病 例。Ray在诊断CFF508基因突变时，出现了25%的ADO率4。Levinson在1992年利 用多重PCR鉴定胎儿性别的研究中其ADO率是21%。最低的ADO率是Storm在168个杂合子细胞的 扩增中仅一个表现为ADO(0.6%)1。在原位PCR中，ADO的发生率也有12%5 。ADO发生的原因主要为：染色体嵌合体，尤其是除了具有二倍体细胞外，有些细胞是单 倍体时，易致误诊，减少这类误诊的唯一办法是从1个囊胚中取2个细胞来分析。在操作前 溶细胞的方法对ADO率的影响较大，用强碱溶解，ADO率较低，Gitlin、Wu等用强碱和DTT及 蛋白酶K两种方法溶细胞，然后用PCR诊断CFF508时，ADO率分别为10%和19%。PCR开始时 的变性温度也非常关键，变性温度分别为90、93、96时，用PCR诊断CFF508基因突 变时，ADO率依次为21%、13%、5%6。此外，为了降低ADO率，除了上述严格的溶细胞条件、变性温度外，许多学者建立了一些 新方法。Findlay提出荧光PCR，即PCR产物通过荧光标记的引物被标记上了荧光，较容易检 测 ，此项技术较常规PCR灵敏7，8。Sermon利用荧光PCR诊断CFF508突变，ADO率 仅5%，用常规PCR对比则为21%1。Kuliev9利用细胞的第一、二极体 诊断-地中海贫血时，从一个杂合子细胞中同时扩增二个突变基因，如扩增结果表现为纯 合子，则表明出现了ADO。Sermon又介绍了多态PCR：扩增CFF508突变和其附近的具有多态 性的第六内含子。根据两个位点的一致性结果来做出诊断是否出现了ADO，从而避免误诊 1。3FISH和原位PCRFISH运用于PGD，首先是鉴别胎儿性别以避免性连锁遗传病的发生，因可 同时检测X、Y染色体，准确性较PCR高；其次可用来诊断染色体非整倍体。重要的是FISH可 以诊断复杂的染色体易位、转位等畸变，但目前关于这方面的进展不大，主要是卵裂球中期 核染色体不易获得；且每例病人都要用一种特异的DNA探针，探针的制备又较繁杂，一般实 验室无法开展。针对这种情况，许多学者进行了尝试：Munne10用自第一极体中 获得的涂染染色体去分析第一极体中的染色体易位。共检测8例平衡易位携带者，其中5例已 妊娠，2例健康的新生儿娩出，使平衡易位携带者的流产率从95%降到12.5%；Conn11 用点探针检测罗伯逊易位携带者的非整倍体，亦获得一定效果。但这两种方法只能检 测来自母体的易位情况，比较局限。湖南医科大学介绍了一种新的探针标记方法：直接对涂 染探针进行PCR标记，通过合适的PCR引物扩增，把生物素渗入到被扩增的DNA链中，该技术 缩短了探针制备的过程12。有专家预言：随着DNA探针标记技术、制备技术、杂 交结果及图像分析技术的发展以及高分辨的FISH作图技术、比较基因组杂交技术的问世，FI SH会得到不断创新和发展，尤其是染色体平衡易位的诊断将广泛应用于临床，从而可大大提 高PGD的准确性和IVF的成功率。为了进一步提高以单细胞底物进行PGD的效率，Thornhill13提出了原位PCR： 在固定于载玻片上的同一个单细胞上，先用PCR原位扩增，再用FISH检测。该技术可使性别 鉴定、单基因病和染色体病的诊断同在一个细胞上进行，被称为目前最先进的技术。经过一 段时间的探索和研究，目前PGD中应用原位PCR时，PCR的有效率为65%，FISH达85%。遗憾的 是Rechisty报道ADO率较常规PCR高。相信随着引物设计及荧光PCR与原位PCR有效的结合，原 位PCR的不足会得到克服且可能逐步替代FISH在PGD中的作用。4结语经过近10年的发展，利用PGD已能成功地诊断囊性纤维化病、-地中海贫血，马凡综合征 、Staeinert病、1-抗胰蛋白酶缺乏病、Lesch-Nyhan综合征等近50种单基因病及染色体 病。据美国的一项问卷调查：PGD避免了流产的痛苦，伦理上易于接受。但在临床应用中，P GD仍有几个问题值得重视。首先，由于试管婴儿成功率较低，妊娠率约20%，分娩率约10%， 而接受PGD的病人一般都有正常的生育率，故对他们而言临床妊娠率低难以接受。其次，PGD 费用昂贵，其研究工作主要集中在英美等发达国家，如何降低PGD的费用，从而使PG D广泛开展，也是亟待解决的的问题。最后，PGD的历史较短，对经PGD而诞生的儿童的未来 健康 状况，尚需长时间随访。有理由相信，随着分子生物学等技术的日新月异，PGD的前景将是 非常令人振奋的!作者单位：朱前勇(第三军医大学附属大坪医院妇产科 重庆，400042)颜建华(第三军医大学附属大坪医院妇产科 重庆，400042)参考文献1,Willy Lissens ,Karen Sermon.Preimplantation genetic diagnosis:curre nt status and new developments.Hum Reprod,1997;12(80):17562,Reubinoff BE,Shushan A.Preimplantation diagnosis in older patients to biopsy or not to biopsy.Hum Reprod,1996;11:207713,Shee U C,Kuang H C,Ming Y W,et al.The simplified two-pipe tte techniqe is more efficient than the conventional three-pipette method for b lastomere biopsy in human embryoes.Fertil Steril,1998;69(3):5694,Ray PF,Winston RML ,Handyside AH.Reduced allele dropout in single -c ell analysis for PGD of cystic fibrosis.J Assist Reprod Genet,1996;13(2):1045,Rechitsky S,Freidine M,Verlinsky Y.Allele dropout in sequential PCR an d FISH analysis of single cell (cell recycling).J Assist Reprod Genet,1996;13(2) :1156,Gitlin SA,Lanzendorf SE,Gibbons WE.PCR amplification specificity: incidence of alllele dropout using different SNA preparation methods for heteroz ygous single cell.J Assist Reprod Genet,1996;13(2):1077,Findlay I,Quirke P,Hall J.Fluorescent PCR:a new technique for PGD of s ex and single gene defcts.J Assist Reprod Genet,1996;13(2):968,Sermon K,Lissens W,Messiaen L,et al.Preimplantation genetic diagnosis of Marfan syndrome with the use of fluorescent poly merase chain reaction and t he automated laser fluorescence DNA sequencer.Fertil Steril,1999;71(1):1639,Kuliev A,Rechitsky S,Verlinsky O,et al.Preimplantation diagnosis of t halassemias.J Assist Reprod Genet,1998;15(5):21910,Munne S,Morrison L,Fung J,et al.Reduction of spontaneous abortion aft t er preconception genetic diagnosis of translocations.J Assist Reprod Genet,1998; 15(4):29011,Munne S,Jingly Fung,Michael J,et al.Preimplantation genetic analysis of translocations:case-specific probes for interphase cell analysis.Hum Genet,19 98;