骨质疏松动物模型.doc

骨质疏松的动物模型骨质疏松症是以骨量减少及骨组织微观结构为特征的一种全身性骨骼疾病，伴有骨的脆性增加、易于发生骨折。骨质疏松症是目前世界上发病率、死亡率和医疗保健消耗较大的疾病之一。骨质疏松起病隐袭，一旦发现，多已发展到一定程度。随年龄增加，骨丢失和骨折发生率明显增加。骨质疏松性骨折可发生在任何部位，但以椎骨、腕部和髋部多见。髋部骨折最为严重，多需手术处理，且患者常合并慢性疾病，如高血压、心血管、慢性呼吸道阻塞疾病及糖尿病等，导致医疗费用和死亡率增加，一部分患者日常生活不能完全独立，年平均生活质量下降。女性由于峰骨量较低及绝经后雌激素水平下降，发病率较男性为高。近年来随着社会老龄化，人口寿命的延长，女性绝经后生存年限约占一生的1/3，据估计，从19902025，欧洲50岁以上妇女将增加3040。男性预计增加更快，可达50。在同一时期内，北美预期将增加83。亚非绝对增加数将为更为明显。在1990年全世界仅髋部骨折达130170万，预期到2025年为200万，甚至更多1。骨质疏松症已成为全世界范围的严重的社会和经济问题。骨质疏松症的预防和治疗已成为一个多学科的、当前研究最活跃的课题之一。建立理想的骨质疏松症的动物模型是对治疗和预防骨质疏松症新药的体内过程、药物代谢动力学、药效学和影响药物作用因素的基础。随着对骨质疏松症的研究的不断深入，认为骨质疏松症的发生与遗传、营养、生活习惯、激素、运动、机械负荷和多种细胞因子有关。对骨质疏松症的动物模型提出了严格的要求。Rodgers等指出理想的动物模型应有三个特点：（1）方便性（Convenience）：动物购来容易，价格低廉，实验操作易行。（2）关联性（Relevance）：与人体条件比较相似，得到的信息能转化为人体的规律。（3）适宜性（Appropriateness）：为研究某一特定问题，最好用特定的动物模型模拟人体2。骨质疏松症的动物模型涉及动物的选择和复制的方法等方面，本文就此将国内外的有关进展进行综述。复制骨质疏松模型的动物选择用于骨质疏松症模型动物模型首先应该考虑的是模型应与人类骨质疏松的临床症状及组织行为相似，但某些动物模型在各个方面完全与人类骨质疏松症的临床表现一致是很困难的，因此动物模型侧重与表现其某一阶段、某些症状或一些病理生理变化，作为观察特定阶段和指征的病理模型。美国骨质疏松药物研究指南（美国FDA）认为目前没有一种动物模型能模拟人类骨质疏松的所有特征。已有报道用小鼠，大鼠、兔、羊、猴等复制骨质疏松模型3。灵长类动物与其他种属相比，有许多优点。灵长类动物保持经常性的直立体位，生物力学与人类最为相似；体内器官系统包括消化系统、内分泌系统、骨代谢与人类接近；饮食要求相似；更重要的是，有些灵长类动物有与女性类似的周期的动情期和绝经4。但费用昂贵，饲养管理要求高，有携带动物源性的传染病，例Marburg病毒病、Eloda病毒病等。小鼠作为骨质疏松动物模型的研究报道较少，但有人证实C57/6J的小鼠峰值骨量低，C3H/HeJ小白鼠的峰骨量高，且由于小鼠基因易于调控，可借助分子生物学技术，对其基因进行研究，以便定位决定峰量骨值的基因。另外，SAM-P/6小鼠有低峰值骨量和中、老年易发生脆性骨折的特点，是唯一证实可随增龄出现脆性骨折的动物5，6。小鼠也存在骨骼太小，可供研究的血清较少，动情期不受下丘脑垂体轴调节等因素影响。羊、猪、狗因为体积大、饲养困难、对去卵巢的组织学反应不一等因素，限制其的应用。大鼠的骨代谢、解剖与人类相似，成年雌鼠由于E2的周期变化，每四天有一个动情期。1岁后雌鼠可观察到动情期的逐渐减少和松质骨的丢失。大鼠卵巢切除后，骨转化率增高；初始的快速骨丢失期，随后的缓慢骨丢失期；骨松质较皮质骨骨丢失严重；肠道钙吸收明显降低，与绝经后骨丢失有众多相似之处7。予雌激素替代治疗时无骨转化增加和失骨8。抑制人骨转化的药物如双磷酸盐类和降钙素也可以有相似的骨组织变化9。其次，大鼠来源丰富，费用低廉，易于饲养管理等的优点。但也有不足之处包括：皮质骨哈佛氏单位重建不明显；1224月后骨骺方闭合；终身维持活跃的骨塑建（modeling）；承载方式与人类不同等。目前，大鼠已成为骨质疏松症研究中使用最多的动物模型。选择骨质疏松动物模型应注意的因素1、 骨生长期和成年期 理想的骨质疏松动物模型应有明确的生长期和成长期。在骨质疏松研究中生长期的骨积累和成年期的骨峰值是重要的概念。在骨生长期，以骨塑建（bone modeling）为主，骨发育的代表是长轴骨的生长，骨塑形能力强，骨代谢活性高。，除了遗传因素，生长期的营养、运动、机械负荷和日照时间等决定峰值骨量。成年期的骨发育是以骨重建为主。，松质骨的骨重建活性高于皮质骨。骨代谢处于相对稳定的状态。测定峰值骨量和成年后的骨量丢失是骨质疏松研究中的重要的手段。进行实验时，明确实验动物处于生长期，还是成年期。如实验目的是研究成年人疾病的过程，应用成年期的动物。若观察危险因素对骨骼系统生长的影响，应选用生长期的动物。2、 骨塑建与骨重建骨塑建（bone modeling）是骨生长期骨的形状和结构的生长变化，还在成年期期调整骨的构筑和骨量分布而适应外力环境的改变。骨重建（bone remodeling）是指骨组织中的基本单位新骨取代旧骨的骨吸收与骨重建过程，并无骨形状的改变。骨质疏松动物模型应可观察到松质骨和皮质骨明确的组织形态学变化。3、 雌激素与绝经大多数妇女经历27年的自然绝经期，手术女性因手术而绝经。体内雌激素水平下降导致多得快速失骨可持续58年，逐渐进入一个缓慢失骨期。这些变化主要发生在松质骨和皮质骨内表面10。雌激素替代疗法可减少骨量的丢失，骨折发生率降低。骨质疏松模型选择的动物如有周期性的月经或动情期，有自然绝经现象和对雌激素替代疗法有良好的反应，可能是用于骨质疏松研究的最佳模型。比如，大鼠去势模型是研究绝经后骨质疏松的经典动物模型。4、 其它动物骨骼的形态、骨密度和骨生理与人类不尽相同，而且骨质疏松症的变化往往经历数年或数十年，但动物模型在数周或数月复制出相像的变化，二者是否有差距，有待进一步研究，因此在实验结果判定和外推时需慎重。复制骨质疏松症的方法骨质疏松动物模型的建立有手术切除卵巢、药物诱导、饮食限制和制动术等几种方法。也有将卵巢切除与其他方法结合应用以加快失骨的报道。1、 切除卵巢去势法以大鼠为例，大鼠有明显的生长期和成年期，雌性大鼠发情期规律，每四天出现一次持续18小时的雌二醇峰值时间。当卵巢切除以后，如上所述，出现骨转化率增加，松质骨出现显著的骨丢失，骨小梁变细，单位体积骨小梁骨量降低，骨强度下降；经历约4月的快速骨丢失期，随后为一段较长的缓慢的丢失阶段。肥胖对骨丢失有一定保护的作用；肠道的钙吸收减少；这种特征较好地复制了女性正常绝经时骨量丢失的情况。予雌激素替代治疗时无骨转化增加和失骨。抑制人骨转化的药物如双磷酸盐类和降钙素也可有阻止大鼠的高转化率和骨丢失。这与绝经后妇女对相同治疗的应用效果一致。该模型已被反复证实，切除大鼠卵巢，血中雌激素水平显著降低，并出现骨质疏松病理变化，该法已成为制造绝经后骨质疏松症动物模型的有效方法。雌激素减少后的骨量的减少和骨形成关系如何尚未阐明。骨骼成熟后，在一生中仍不断进行更新与改造，这就是骨重建。骨重建过程是旧骨的吸收，新骨的形成的复杂过程。主要有两种细胞在发生作用：一种是通过分解代谢促使骨质吸收的破骨细胞，一种是通过合成代谢促进骨形成的成骨细胞。正常的骨再建过程有赖于这两种细胞作用的平衡。在骨表面同时存在着破骨细胞和各个分化阶段的成骨细胞，无论在组织学上，还是在功能上都做为一个生理单位发生作用，这一系列的细胞群被称为基本的多细胞单位(basic multicelluar unit,BMU)。任何一种可以改变破骨细胞活性和成骨细胞分泌能力的因素均可对骨的再建产生深刻的影响。雌激素通过多个环节维持骨吸收和骨形成的平衡。（1）雌激素增加降钙素的分泌,抑制甲状旁腺激素的活性,从而抑制骨钙溶解、促进钙在肠内的吸收、帮助活性维生素D(1,25-二羟维生素D)在肾脏的合成、促进骨的重建。(2)而且许多研究发现骨细胞内存在雌激素受体。实验表明, 在成骨细胞上存在雌激素受体。雌激素具有刺激骨形成作用,破骨细胞是雌激素的靶细胞11。(3)雌激素通过影响局部的细胞因子如IGF-I、TGF-、IL-1、TNF、IL-6等而调节成骨细胞与破骨细胞的功能状态，进而影响骨代谢12。2、 药物诱导常用诱导骨质疏松动物模型有维甲酸和糖皮质激素。维甲酸是维生素A的衍生物，临床上作为治疗白血病的药物，对骨代谢有明显的影响，大鼠维甲酸70mg/kg灌胃两周，即出现骨密度降低，骨小梁吸收，断裂，稀疏；骨髓腔增大。骨矿含量降低,骨板结构破坏及骨骼负重功能损害;骨生成减少而骨吸收增加等。利用这一特性，可成功复制出骨质疏松动物模型。在造型过程中，动物会出现厌食，体重减轻，倦怠等表现，且易感染。此模型的组织形态学改变，及对雌激素治疗的反应与人类有较好相似性13。是大鼠急性骨质疏松的复制方法。维甲酸诱导大鼠骨质疏松主要是激活破骨细胞的分化、增殖，促进骨吸收作用，而造成骨吸收大于骨形成的负平衡状态，造成骨丢失。同时文献报道，维甲酸可造成卵巢重量明显减轻，子宫萎缩，维甲酸有损伤卵巢功能的作用，雌激素水平下降14，体内雌激素减少是导致骨质疏松的主要原因。柯兴氏综合症或接受皮质类固醇激素治疗的病人，约半数发生骨质疏松，借此，予动物大剂量长期使用皮质类固醇激素可诱导骨质疏松模型，常用强的松或强的松龙，皆可观察到显著的骨丢失。糖皮质激素直接抑制成骨细胞的功能，减少前成骨细胞向功能性成骨细胞转化，降低前成骨细胞的骨胶原的合成，使骨基质形成减少，破骨细胞间接由于偶联因素及PTH增加的刺激而骨吸收加速15。血钙水平下降，是皮质类固醇抑制小肠钙吸收的结果。又进而刺激PTH分泌，血清降钙素浓度轻度下降，也是骨吸收活跃的原因。皮质类固醇可抑制肾小管对钙磷的重吸收16。此模型在一定程度上模拟骨形成减少的变化。但不够理想，原因在于动物真正的骨生成减少较为少见。并且与原发性骨质疏松的发病机理与病程不一致，因此不适合用于观察药物对骨吸收抑制作用的研究模型。3、 饮食限制决定和影响骨量的因素可概括为遗传因素和环境因素。其中环境因素有营养、体力活动和生活习惯等。营养对骨量的维持有必不可少的作用，特别是其中的蛋白质及钙质。但只是环境因素之一，对骨量的影响较小。因其是可控因素，加之骨量的微细变化可致骨折风险大大增加，所以合理的营养在原发性骨质疏松的防治上有一定作用。骨质疏松的饮食危险因素包括钙摄入减少，蛋白质、维生素D不足，膳食中的钠、有机磷含量过高等17。钙是人体含量较多的元素之一，99的钙存在骨骼和牙齿中，对维持骨骼的结构与功能，以及保持血钙有重要的作用。其余1%的体钙分布于各种细胞和细胞间液中，具有多种生理功能。当钙摄入不足、钙吸收功能低下或高钙排出使机体缺钙时，可继发引起甲状旁腺激素(PTH)分泌增多，使骨吸收亢进，长期缺钙将导致骨量丢失，发生骨质疏松症。另外，有报道骨量与遗传、机械负荷、骨峰量值和营养内分泌状况等有关。从胎儿时期保持充足的钙摄入量，可以提高骨峰量值。骨峰量值增高，骨储备多，对中老年的骨量丢失缓冲能力强，使骨量减少保持在阈值以上，从而延缓或减轻骨质疏松的发生18。大鼠在幼时钙摄入不足，其骨峰量值下降，而低骨峰量值使增龄后骨质疏松发生的风险大大增加19。其次，有流行病调查报道，人群中蛋白质摄入量与骨密度显著负相关20。高蛋白摄入使尿中代谢固定酸含量增加，肾近曲小管钙重吸收减少，尿钙增加，同时激发胰岛素与胰岛素生长因子对骨细胞调节作用21。蛋白质摄入大多与磷结合，同时增加磷的吸收。后者能减少尿钙排泄，抵消高蛋白摄入引起的尿钙增加，但磷使钙从粪便中排泄量上升，所以过多的蛋白摄入的净效应是增加负钙平衡22。另外，无论男性或女性，随着增龄其日照时间减少，维生素D合成不足，体内钙吸收不足。如发生在高龄人群，常加速骨量的丢失。研究表明，高磷摄入导致高磷血症、低钙血症、骨丢失和软组织钙化等，主要与继发性甲状旁腺功能亢进有关23。以上单因素营养因素控制造成大鼠骨质疏松动物模型，往往易受其他因素的影响，而且建立模型所需时间长，一般需40周以上。因此需以低钙饲料为主，辅以其他危险因素或药物等联合造成大鼠骨质疏松模型。4、 制动法废用性骨质疏松或骨丢失模型，是人工方法使动物部分肢体处于不负重状态而建立的活体模型。由于动物肢体的骨量和骨代谢与复制、肌肉活动、神经血管对肌肉骨骼的营养等因素密切相关。复制的方法很多，常用的是机械固定法、悬吊法、腱切除法和离断坐骨神经等。其中机械固定法和悬吊法优点在于在同一动物上即可研究失重时的骨丢失，又可以观察承重肢超重时骨代谢变化，去除固定后还能观察骨质疏松的恢复。且易于操作24。总结 随着新技术的不断涌现和对骨质疏松的认识的深入，骨质疏松动物模型也不断地改进，有必要对各种骨质疏松动物模型的特点和机理进行深入的研究。在评价新药的防治效果时，应注意选用适宜的动物和造模方法，药物作用机理与造模方法在病因学上的一致性。只有使用标准的、与人类骨质疏松相关性强的动物模型，才能得到可靠地研究数据，准确评价实验的结果。参考文献1、 Cooper C, Campion G, Melton LJ, Hip fractures in the elderly: a world-wide projection. 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