甘蓝与大白菜的原生质体融合(2).pdf

安徽农业科学 J o u r n a lo f A n h u iA g i S c i 2 0 0 9 3 7 8 3 4 4 8 3 4 4 9责任编辑李菲菲责任校对丁冬梅 甘蓝与大白菜的原生质体融合 梁丹1 丁丹1 Y k 旭1 2 1 辽宁师范大学生命科学院 辽宁大连1 1 6 0 2 9 2 辽宁省植物生物技术重点实验室 辽宁大连1 1 6 0 2 9 摘要 目的 研究两种近缘物种原生质体的最佳融合条件 方法 利用培养好的甘蓝与白菜的幼苗在果胶酶与纤维素酶的作用下 分离出原生质体 再利用P E G 融合液将这2 种原生质体融合 结果 用6 甘露醇 8 纤维素酶 2 果胶酶处理材料 酶解4h 后 可以获得大量的游离原生质体 大部分原生质体呈圆形 散乱地游离在原生质体溶液各处 利用3 0 P E G 融合液及0 1m o L L C a C I 溶 液 舍9 甘露醇 p H 值9 5 将这两种原生质体融合可以获得稳定的 可育的细胞杂种植株 可以直接作为育种的种质材料 结论J 该研究为远缘杂交和进一步研究原生质体的培养及再生奠定了基础 关键词甘蓝 大白菜 原生质体融合 中图分类号S6 3 4 3文献标识码A文章编号0 5 1 7 6 6 l l 2 0 0 9 0 8 0 3 4 4 8 0 2 P r o t o p l a s tF u s i o no fB r a s s i c ao l e r a c e aa n dB r a s s i c ap e k i n e n s i s L L N GD a ne ta l C o l l e g eo fL i f eS c i e n c e L i a o n i n gN o r m a lU n i v e r s i t y D a l i a n L i a o n i n g1 1 6 0 2 9 A b s t r a c t O b j e c t i v e T l ea i mw a st os t u d yt h eo p t i m u mf u s i o nc o n d i t i o no fp r o t o p l a s tf r o m2r e l a t i v es p e c i e s M e t h o d 1 1 l ep r o t o p l a s t s w e r es e D a r a t e df r o mt h ec u l t u r e ds e e d l i n g so fB r a s s i c ao l e r a c e aa n dB r a s s i c ap e k i n e n s i sw i t ht h ef u n c t i o no fp e e t i n a s ea n de e l l u l a s ea n dt I l e2 p r o t o p l a s t sw e r ef u s e db yP E Gf u s i o nl i q u i d R e s u l t Ag r e a td e a lo ff r e ep r o t o p l a s t sc o u l db eo b t a i n e db yu s i n g6 m a n n i t o l 8 c e l l u 1 0 s e 2 p e c t i n a s et ot r e a tt h em a t e r i a lf o r4h M o s tp r o t o p l a s t sw e r er o u n da n dd i s s o c i a t e di n t h ep r o t o p l a s ts o l u t i o ni r r e g u l a r l y U s i n g 3 0 P E Gf u s i o nl i q u i da n d0 1m o L LC a C I s o l u t i o n c o n t a i n i n g9 m a n n i t o l p Hv a l u e9 5 f o rp r o t o p l a s tf u s i o nc o u l do b t a i n s t a b l ea n d f e r t i l ec e l lh y b r i dp l a n t sa n dt h ep r o t o p l a s tc o u l db eu s e da st h eg e r m p l a s mm a t e r i a l sf o rb r e e d i n g C o n c l u s i o n T h er e s e a r c hl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rd i s t a n th y b r i d i z a t i o na n df u r t h e rs t u d yo ft h ec u l t u r ea n dr e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t K e yw o r d sB r a s s i c ao l e r a c e a B r a s s i c ap e k i n e n s i s P r o t o p l a s tf u s i o n 大白菜与甘蓝是我国主要的蔬菜作物 近十几年对其研 究有很大的进展 白菜与甘蓝的原生质体融合在理论和实 践上都有很大的意义 在植物遗传工程和育种研究上具有广 阔的应用前景 原生质体融合是植物同源 异源多倍体获得 的途径之一 它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍 也可 以克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的困难 植物原生质体是除去细胞壁后为质膜所包围的 裸露细 胞 是开展基础研究的理想材料 其中 酶解法分离原生质 体是一个常用的技术 植物细胞壁主要由纤维素 半纤维素 和果胶质组成 因而使用纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成 分 除去细胞壁 目前许多化学 物理学和生物学方法可诱 导原生质体融合 现在被广泛采用并证明行之有效的融合方 法是聚乙二醇 P E G 法 高C a 高p H 值法和电融合法 由于 试验条件限制 该试验采用P E G 法 P E G 是一种高分子化合物 2 0 一5 0 的浓度能对原生 质体产生瞬间冲击效应 使原生质体很快发生收缩与粘连 再用高C a 高p H 值法进行清洗 使原生质体融合得以完成 笔者将利用白菜与甘蓝的下胚轴与子叶在果胶酶与纤 维素酶的作用下分离出原生质体 冉利用P E G 融合液使原 生质体融合 1 材料与方法 1 1 材料试验用大白菜和甘蓝种子来源于大连市种子公 司 所需溶液配制如下 6 甘露醇溶液 O 7m m o l L K H 2 P 0 4 1 0 0m m o l LC a C l 2 2 H 2 0 6 甘露醇 1 8 甘露醇 溶液 0 7m m o l LK H P 0 4 1 0 0m m o l LC a C I 2 H O 1 8 甘 露醇 2 果胶酶溶液 2 纤维素酶溶液 8 纤维素酶溶 液 P E G 融合液 3 0 P E G 0 3m o l L 葡萄糖 3 5m m o l L 基金项目 作者简介 收稿E t 期 辽宁省教育厅资助项目 0 5 1 2 1 3 梁丹 J 9 8 2 一 女 噩宁北镇人 硕士研究生 研究方向 植 物学 通讯作者 2 0 0 8 1 2 3 l C a C l 2 H O 0 7m m o L LK H 2 P 0 4 6 C P W 洗液 1 5 0 0 m s LK H 2 P 0 4 2 0 2m s LK N 0 3 14 8 0 0m s LC a C l 2 2 H 2 0 2 4 6 0m g LM g S 0 4 7 H 2 0 9 甘露醇 用T r i s 调p H 值到 6 0 高C a 高p H 值溶液 O 1m o l LC a C l 2 2 H 2 0 6 甘露醇 溶液 用T r i s 调p H 值到9 5 1 2 方法 1 2 1 播种及幼苗的培养 精选饱满的白菜 甘蓝种子 用 0 1 升汞表面消毒1 0r a i n 再用无菌水洗涤4 次 将种子接 入1 2M S 培养基中 置于温度 2 5 4 2 光照度10 0 0I x 光照1 4 1 6h d 的条件下培养7d 左右 一 1 2 2lr I I l 体系酶液的配制 根据文献资料 设立几个不 同的组合建立1r n l 酶液体系 在小烧杯当中分别加入甘露 醇溶液和果胶酶溶液及纤维素酶溶液 准备用于酶解子叶和 下胚轴的细胞壁 1 2 3 材料处理 用剪子和镊子剪碎甘蓝的子叶放进建立 好的lr r I l 酶液当中进行酶解 再剪下大白菜的下胚轴放入一 个小的培养皿当中 并用镊子固定住下胚轴的一端 用刀片 从下胚轴的中间割破 然后用剪子剪碎并放人建立好的1I I l l 酶液体系中进行酶解 1 2 4 酶解 设立几个不同的时间段酶解原生质体 并用 倒置显微镜观察原生质体状态 1 2 5 过滤 将酶解完全的大白菜的下胚轴原生质体和 甘蓝的子叶原生质体分别放入1 5 0 目 3 0 0 目的尼龙膜中进 行过滤 以除去未完全消化的残渣 因为大白菜下胚轴和 甘蓝子叶的原生质体大小不同 所以要用不同目的尼龙膜进 行过滤 1 2 6 洗涤 将过滤好的原生质体分别放入2 个离心管当 中配平后在6 0 0r r a i n 下离心5m i n 弃上清取酶液 留少许 上清液 以免挂壁的原生质体干死 再加3m l1 6 C P W 洗 液在6 0 0r m i n 下离心5m i n 吸去上清液 1 2 7 纯化 分别将大白菜下胚轴原生质体和甘蓝子叶原生 万方数据 7 卷8 期梁丹等甘蓝与大白菜的原生质体融合 3 4 4 9 质体平铺在2 0 及1 8 蔗糖溶液下 在6 0 0r m i n 下离心3 m i n 去细胞碎片及不完整原生质体 使得原生质体得到纯化 1 2 8 聚集 取下胚轴和子叶上层溶液于一个离心管中 在6 0 0r r a i n 下离心1 0r a i n 去上清 混匀剩下的少许溶液滴 在培养皿中间 静置1 0 1 5m i n 使原生质体可以沉淀 1 2 9 原生质体融合的诱导 向原生质体溶液周围滴加 P E G 融合液 静置1 0 1 5m i n 使原生质体粘连在一起 然后 继续向原生质体溶液周围滴加高p H 值高c a 溶液 p H 值 9 5 使原生质体融合 大约4 5h 内可以通过倒置显微镜 观察到原生质体的融合现象 2 结果与分析 2 1 酶解条件的优化建立不同浓度配比的l1 1 1 l 酶液体系 y 甘露醇 V 纤维素 V 果胶酶 2 1 1 后处珲材料 发现 1 8 甘露醇由于浓度大 渗透势变大 导致细咆破裂 而6 甘露醇则与细胞液浓度一致 能够维持细胞状态 2 纤维 素酶由于浓度不适宜 导致细胞酶解不完整 8 纤维索酶 2 果胶酶则可以较完整地酶解材料 获得完整原生质体 最终获得优化体系 6 甘露醇 8 纤维素酶 2 果胶酶 2 2 酶解时间的优化在确定酶液成分及浓度后 要对酶 解时间进一步确定 以每小时为单位 设置几个时间梯度进 行观察 结果发现 2 3h 酶解不充分 游离的原生质体很 少 而在4 5h 的时候酶解比较充分 可以获得大量的游离 原生质体 在7h 以后 原生质体开始出现破裂现象 最终获 得最佳酶解时间为4h 2 3 原生质体分离结果在材料酶解4h 后 去少许溶液进 行观察原生质体状态 大部分均呈圆形 散乱地游离在原生 质体溶液各处 单个观察如图1 所示 注 A 白菜下胚轴原生质体 B 甘蓝子叶原生质体 N 吐e A H y p o c o t y lp r o t o p l a s t so fc a b b a g e B C o t y l e d o np m t o p l t so fc a b b a g e 图1 游离的原生质体 F i g 1 F r e ep r o t o p l a s t S 2 4 原生质体融合结果两种原生质体加入P E G 融合液后 只发生粘连 在洗涤过程中才发生膜融合 核融合通常于融合 体第一次有丝分裂过程中发生 原生质体融合如图2 所示 3 讨论 该试验利用P E G 法将大白菜与甘蓝原生质体进 t i t 融 合 首先利用培养好的甘蓝与白菜的幼苗在果胶酶与纤维素 酶的作用下分离出原生质体 再利用P E G 融合液将这两种原 生质体融合 为进一步的原生质体培养及再生奠定了基础 注 A 融合处理后2 0h 细胞的状态 B 融合处理后2 5h 细 胞的状态 N o t e A C o n d i t i o no fc e l l s2 0h o u r sa f t e rf u s i o np r n c e s s B C o n d i t i o no fc e l l s2 5h o u r sa f t e rf u s i o np r o c e s s 图2 原生质体融合过程 F i g 2 F u s i o np r o c e s so fp r o t o p l a s t s 由于不同的材料所用酶种类 酶量 酶解时间及渗透势 不同 所以要对分离条件一一进行优化筛选 通过观察发 现 在9 甘露醇 1 纤维素酶 l 果胶酶 6 5h 的酶 解时问的条件下 原生质体的产量及质量较高 现在广为使用的原生质体融合方法有聚乙二醇 P E G 法 高c a 高p H 值法和电融合法 在试验中观察到 P E G 法 与高C a 高p H 值法结合使用能够让原生质体更好地融合 P E G 使原生质体发生粘连 而高C a 高p H 值溶液则町以起到 刺激作用 使粘连的原生质体发生融合 该试验是近缘物种间的原生质体融合 这种融合方式可 以获得稳定的 可育的细胞杂种植株 可以直接作为育种的 种质材料 通过该试验 可以为远缘杂交奠定基础 远缘不 亲和的物种间的原生质体融合 可以获得常规有性杂交得不 到的无性杂交植株 这不仅克服了远缘杂交不亲和性 还可 以扩大变异范围 产生新的种质 参考文献 I 孙敬三 梓耀林 植物细胞I j 程实验技术 M 北京 科学出版社 1 9 9 5 2 何q k 华 胡芳名 谢碧霞 等 枣树原生质体分离条件的研究 J 中南 林学院学报 1 9 9 9 1 9 1 2 0 2 3 3 佚名 清华学掌教学软什库 E B O L 2 0 0 4 1 1 0 1 h t t p 1 6 6 1 1 1 3 0 1 6 1 8 0 0 0 k e j i a n m a t e r i a c e l V e x p e f m e n t 4 B H A R T E N D UV A T S Y A B H A S K A I L NS P l a n tr e g e n e r a t i o nf r o me 埘y l e d o n a r yp r o t o p a s L so fc a u l i f l o w e r B r a s s i c ao l e r a c e aV a l b o t r y t sL j P r o t o p l n s m 1 9 8 2 1 1 3 1 6 1 1 6 3 5 L I M A S Z E W S K AK K E L L E RWA P l a n tr e g e n e r a t i o nf r o ms t e mc o r t e x p m t o p l a t so fB r a s s i c a 唧W j P l a n t C e l l T i s s u ea n do e mC u l t u r e 1 9 8 7 8 2 2 5 2 2 3 6 J A R L C I B O K E L M A N N G S D E H A A SJM P r o t o p l a s tr e g e n e r a t i o na n d f u s i o ni nC u c u r r d s m e l o nx c u c u m b e r j P l a n t C e l l T i s s u ea n dO r g a nC u l t u r e 1 9 9 5 4 3 2 5 9 2 6 5 万方数据 甘蓝与大白菜的原生质体融合甘蓝与大白菜的原生质体融合 作者 梁丹 丁丹 王火旭 作者单位 梁丹 丁丹 辽宁师范大学生命科学院 辽宁大连 116029 王火旭 辽宁师范大学生命科学 院 辽宁大连 116029 辽宁省植物生物技术重点实验室 辽宁大连 116029 刊名 安徽农业科学 英文刊名 JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES 年 卷 期 2009 37 8 被引用次数 3次 参考文献 6条 参考文献 6条 1 孙敬三 桂耀林 植物细胞工程实验技术 1995 2 何业华 胡芳名 谢碧霞 枣树原生质体分离条件的研究 期刊论文 中南林学院学报 1999 01 3 佚名 清华学堂教学软件库 2004 4 BHARTENDU VATSYA BHASKARAN S Plant regeneration from cotyledonary protoplasts of cauliflower Brassica oleracea var botrytis L 1982 5 LIMASZEWSKA K KELLER W A Plant regeneration from stem cortex protoplasts of Brassica napus 1987 6 JARL C I BOKELMANN G S DEHAAS J M Protoplast regeneration and fusion in Cucumis melon cucumber 1995 本文读者也读过 9条 本文读者也读过 9条 1 孙慧慧 王力军 闫晓红 叶永忠 魏文辉 植物原生质体融合培养技术及其应用 期刊论文 河南农业科学2010 7 2 王丽爽 易继财 张宗申 WANG Li shuang YI Ji cai ZHANG Zong shen 亚麻与红麻的原生质体融合 期刊论文 广东农业科学2010 37 4 3 赵军良 逯保德 梁爱华 赵美华 ZHAO