板栗总苞的化学成分及其抗菌活性.doc

板栗总苞的化学成分及其抗菌活性焦启扬，吴立军，孙博航，黄健，高慧媛基金项目：河北省唐山市科技局基金项目作者简介：焦启扬，硕士研究生 通讯作者：高慧媛(1971-)，女(汉族)，河北乐亭人，副教授，博士, 主要从事天然产物活性成分的研究。Tel. E-mail 。 (沈阳药科大学 中药学院 ,辽宁 沈阳 110016)摘要目的 体外抗菌实验结果显示板栗Castanea mollissima Blume总苞的95()乙醇提取物具有抗菌活性, 对总浸膏的化学成分进行分离和结构鉴定,。方法 采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和重结晶等多种分离方法对板栗总苞的95()乙醇提取物的化学成分进行分离，并通过理化性质、谱学分析等方法对化合物进行结构鉴定；结果 分离得到18个化合物，分别鉴定为5-羟甲基糠醛(1)、没食子酸 (2)、对羟基苯甲酸 (3)、对苯二酚(4)、麦角甾-6,22-二烯-3,5,8三醇 (5)、莽草酸(6)、豆甾-4-烯-6-3酮(7)、 Ganschisandrin (8)、齐墩果酸(9)、山柰酚-3-O- (6-反式-对-香豆酰基) -D-葡萄吡喃糖苷（10）、 山柰酚-3-O- (6,- 双-反式-对-香豆酰基)-D-葡萄吡喃糖苷(11)、2-羟基-丁二酸二丁酯(12)、槲皮素(13)、大黄素(14), 3,3-dimethoxylarreatricin(15)、原儿茶酸(16)、乌索酸(17)、山柰酚(18)。结论 板栗总苞的95乙醇提取物的总浸膏及水层对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌均有一定的抑性活性；化合物7、8、9、12为首次从栗属植物中分离得到，化合物6、14为首次从该种植物中分离得到。关键词：板栗总苞；化学成分；结构鉴定 中图分类号：R 284 文献标识码：AChemical constituents from the involucre of Castanea mollissima Blume and its anti-bacteria activityJIAO Qi-yang, WU Li-jun, SUN Bo-hang, HUANG Jian, GAO Hui-yuan (School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016 ,China)ABSTRACT: OBJECTIVE The result in vitro showed the inhibition effect on bacteria and to isolate the chemical constituents and elucidate their structures from the involucres of Castanea mollissima Blume. METHODS The compounds were isolated by chromatogrammphy on silica gel columns, Sephadex LH-20 and recrystallizing methods. NMR and TLC were employed for the structural identification. RESULTS Eighteen compounds were obtained and elucidated as hydroxymethylfurfural (1), gallic acid (2), p-hydroxy benzoic acid (3), hydroquinone (4), ergost-6,22-diene-3,5,8-triol (5), shikimic acid (6), stigmast-4-en-6-ol-3-one (7), Ganschisandrin (8), oleanolic acid (9), kaempferol-3-O- 6-O-(E)-p-coumaroyl-D-glucopyranoside (10), kaempferol-3-O- 6,2-di-O- (E) -p-coumaroyl -D-glucopyranoside (11), 2-hydroxy-1,4-dibutylbutanedioate (12), quercetin(13), emodin(14), 3,3-dimethoxylarreatricin (15), 3,4-Dihydroxybenzoic acid(16), ursolic acid(17), kaempferol(18) respectively. CONCLUSION The 95% EtOH extraction and water layer showed the inhibition effect on Bacillus coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus. Compound 7, 8 , 9 , 12 were isolated form Castanea genus for the first time, and compound 6 ,14 were obtained from this plant for the first time.KEY WORDS: Castanea mollissima Blume; chemical constituents; structural elucidation; anti-bacteria activity 板栗(Castanea mollissima Blume)又名栗子，是壳斗科栗属的落叶果木。板栗的总苞为板栗毛壳，又名风栗壳、板栗壳斗。据中药大词典记载，板栗壳性甘、平、涩、无毒, 具有健脾益气、补肾强筋、散结解毒之功效。可治疗丹毒、肿毒、瘰疬等疾病1，在民间常作为抗菌、抗炎用植物药。有药理研究表明板栗总苞的水煎液、醇溶物、乙酸乙酯提取物均有抗菌活性2，但对其活性部位的化学成分却并未见文献报道。此外我国板栗资源极其丰富，果肉的深加工越来越受到重视，但由此产生的板栗总苞则大部分作为废物，造成了资源的巨大浪费。本研究采用体外抗菌活性试验对板栗总苞的95%()乙醇提取物的抗菌活性进行了评价，结果表明其提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及藤黄微球菌均有不同程度的抑制活性。通过现代化学分离方法对抗菌活性部位的化学成分做了研究。采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和重结晶等方法从中分离纯化得到了18个化合物，经谱学解析对结构进行了鉴定。本文报道化合物的分离鉴定过程。1 仪器、试剂和材料Bruker ARX-300，AV-600型核磁共振仪（瑞士Bruker公司）。薄层色谱用硅胶G，H，GF-254和柱色谱用硅胶（青岛海洋化工有限公司），其他所用试剂为天津康科德试剂（分析纯）、天津大茂试剂（分析纯）。Sephadex LH-20为Pharmacia公司产品。板栗总苞药材2006年采自河北省迁西县。由沈阳药科大学中药鉴定教研室孙启时教授鉴定为板栗( Castanea mollissima Blume)的外壳，样品存放于本实验室。2 抗菌活性筛选本文采用双层平板纸片扩散法筛选样品的抗菌活性3。2.1样品板栗总苞95%()乙醇提取总浸膏溶于DMSO中，配置成供试品溶液。 2.2试验菌株：大肠杆菌（Bacillus coli 44102）、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 26003)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus 28001)2.3结果：见Table.1 Table.1板栗95%()乙醇提取物的抗菌活性大肠杆菌（Bacillus coli）金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)藤黄微球菌(Micrococcus luteus)板栗总浸膏+注： 表中“+” 表示样品有抗菌活性，但活性弱于阳性药品卡那霉素。“+”表示样品有抗菌活性，且活性强于阳性药品卡那霉素。3 提取与分离 板栗总苞粉末5 .0Kg用95%()的乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩，得提取物重1.0 Kg，用去离子水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液减压浓缩，包括水层得4个萃取部分。 取石油醚层27g、乙酸乙酯层60g、正丁醇层400g。所得馏分经反复硅胶柱色谱，凝胶柱色谱和重结晶等方法分离纯化，石油醚层得到化合物5(15mg)、7(20mg)、8(5mg)、11（25mg）、16（13mg）。乙酸乙酯层得到化合物1(18mg)、4(4mg)、9(25mg)、10(2.1g)、12（453mg）、13(15mg)、15(10mg)、 17(25mg)、18（125mg）。正丁醇层得到化合物2(3.8g)、3(1.1g)、6(53mg)、14(11mg)。4 结构鉴定化合物1：淡黄色油状物(CHCl3), 1H-NMR（300 MHz，CDCl3），:2.77 (1H, s, -CH2-), 4.72(1H, s,-OH) , 6.53 (1H, d ,J=3.5, 8.4Hz, 4-H), 7.23 (1H, d, J=3.5, 8.4Hz, 3-H), 9.58 (1H, s,-CHO),与文献4报道的5-羟甲基糠醛谱学数据相一致，鉴定为5-羟甲基糠醛。化合物2：白色结晶(MeOH)，m.p.236-238。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6），:6.91 (2H, s, 2,6-H), 9.14(1H, s, -OH)；13C-NMR（75 MHz，DMSO-d6），:108.8（C-2,6）、145.4(C-3, 5)，120.5(C-1), 138.0(C-4), 167.5 (-COOH)，数据与文献5报道的没食子酸的谱学数据相一致，鉴定其为3,4,5三羟基苯甲酸，即没食子酸。化合物3：白色针晶(MeOH), m.p.213-214。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6），:7.79 (2H, d, J = 8.4Hz, 2,6-H)，6.80 (2H, d, J = 8.4 Hz, 3,5-H), 12.21 (1H，s, -COOH)，10.26 (1H，s, -OH), 与文献6报道的对羟基苯甲酸的谱学数据一致，鉴定其为对羟基苯甲酸。化合物4：无色针状结晶（MeOH），m.p. 171。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6），:8.60(1H, s, -OH)， 6.54(2H, s, H-2, 3, 5, 6)；13C-NMR（75 MHz，DMSO-d6），:150.0(C-1, 4)、116.0(C-2, 3, 5, 6)，谱学数据与文献7报道的对苯二酚的谱学数据相一致，鉴定其为对苯二酚。化合物5：白色粉末（氯仿）m.p.175-177。1H-NMR(CDCl3, 300 MHz)，3.97 (1H, m)，5.20 (2H, dd) 示为2个烯烃质子信号，:6.50 (1H, d, J = 6.0 Hz)，6.23 (1H, d, J = 6.0 Hz)为环上互为偶合的2个烯烃质子信号；13C-NMR（CDCl3，75 MHz），:36.9(C-1)、30.1（C-2）、66.4（C-3）、34.9（C-4）、79.4（C-5）、130.7(C-6)、135.4（C-7）、82.2(C-8)、51.1(C-9)、37.1(C-10)、20.6(C-11)、39.3(C-12)、44.5(C-13)、51.7(C-14)、28.6(C-15)、23.4(C-16)、56.2(C-17)、12.6(C-18)、18.2(C-19)、39.7（C-20）、19.6(C-21)、132.8(C-22)、135.2(C-23)、42.3(C-24)、33.1(C-25)、17.5(C-26)、20.9(C-27)、19.9(C-28)，以上谱学数据与文献报道的麦角甾-6,22-二烯-3,5,8-三醇8数据相一致，鉴定其为麦角甾-6,22-二烯-3,5,8-三醇（ergost-6, 22-diene-3, 5, 8-triol）。化合物6：白色针状结晶（MeOH），m.p.184-185，-164.0(c 0.44, MeOH)。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6），:2.01 (1H, dd, J=18.0, 2.8Hz, 6-H), 2.47 (1H, dd, J=18.0, 2.7Hz, 6-H)，6.55 (1H, s, 2-H)，4.20 (1H, s, 3-H), 3.82 (1H, dd, J=4.8, 6.7, 5-H), 3.54(1H, t, J=4.8, 4-H)；13C-NMR（DMSO，75 MHz），:168.3 (-COOH) 、138.4（C-2）、128.9（C-1）、70.5（C-3）、67.0（C-4）、65.6（C-5）、30.2（C-6），以上数据与文献9报道的-(-)莽草酸的谱学数据相一致，故鉴定为-(-)莽草酸。化合物7：白色结晶（CHCl3）m.p.211-213。1H-NMR（300 MHz，CDCl3），: 4.35(1H, s, H-6)，5.82(1H, s, H-4)；13C-NMR（75 MHz，CDCl3）:37.1（C-1），34.3（C-2），200.4（C-3），126.3（C-4），168.4（C-5），73.3（C-6），38.5（C-7），29.7（C-8），53.6（C-9），38.0（C-10），21.0（C-11），39.6（C-12），42.5（C-13），56.0（C-14），24.1（C-15），29.1（C-16），56.0（C-17），12.0（C-18），19.5（C-19），36.1（C-20），19.0（C-21），34.2（C-22），26.0（C-23），45.8（C-24），29.7（C-25），18.7（C-26），19.8（C-27），23.1（C-28），12.0(C-29)。以上数据与文献10报道的豆甾-4-烯-6-醇-3-酮的谱学数据相一致，故鉴定其为豆甾-4-烯-6-醇-3-酮(stigmast-4-en-6-ol-3-one)。化合物8：无色油状物（CHCl3）。ESI m/z: 373.3M+H+。1H-NMR(CDCl3, 600 MHz) ：3.89 (12H, s)为4个甲氧基质子信号，6.99-6.80(6H, m)为六个芳香质子信号，结构中有两个苯环，1.00 (3H, d, J = 6.3 Hz, 3-CH3), 0.61 (3H, d, J = 6.6 Hz, 4-CH3) ，5.44 (1H, d, J = 4.2 Hz, H-5), 4.63 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-2)。其碳谱数据见Table 2。结构中的呋喃环上取代基的相对构型用NOESY谱进行了验证，观察到了两个甲基:0.61 (4-CH3), 1.00 (3-CH3)和:4.63 (H-2)之间的NOE相关峰，而与H-5没有NOE效应，以上数据和文献11的数据相一致，鉴定该化合物为ganschisandrin，其结构式见Fig.1。化合物9：白色粉末（MeOH）， 1H-NMR(300MHz, DMSO-d6)，:5.15（1H, s, 12-H），4.28（1H, m, 3-H）；13C-NMR（CDCl3，75 MHz），:38.5(C-1)、27.0(C-2)、77.0(C-3)、38.8(C-4)、54.9(C-5)、18.1(C-6)、32.9(C-7)、40.9(C-8)、47.2(C-9)、36.7(C-10)、23.0(C-11)、121.6(C-12)、143.9(C-13)、41.4(C-14)、27.3(C-15)、23.5(C-16)、45.8(C-17)、41.4(C-18)、45.5(C-19)、30.5(C-20)、33.4(C-21)、32.2(C-22)、28.3(C-23)、15.2(C-24)、16.1(C-25)、16.9(C-26)、25.7(C-27)、178.7(C-28)、33.0(C-29)、23.5(C-30)。以上谱学数据和文献记载的齐墩果酸的谱学数据12相一致，故鉴定该化合物为齐墩果酸（oleanolic acid）。化合物10：黄色粉末（MeOH），m.p.214-216. 盐酸-镁粉及Molisch反应均为阳性，示为黄酮苷类化合物。1H-NMR (600MHz, pyridine-d5)， 6.70(1H, br s, H-6), 6.70(1H, br s, H-8)，8.45(2H, d, J=8.4 Hz, H-2, H-6), 7.14(2H, d, J=8.4 Hz, H-3, H-5)，7.16(2H, d, J=8.4 Hz, H-3, H-5)，7.51(2H, d, J=8.4 Hz, H-2, H-6)。其碳谱数据归属见Table 2，与文献13中山柰酚-3-O-(6- 反式-对-香豆酰基)- -D-葡萄吡喃糖苷的碳氢谱数据对照相一致，故确定为山柰酚-3-O-(6- 反式-对-香豆酰基)-D-葡萄吡喃糖苷（kaempferol-3-O-6-O-(E)-p-coumaroyl -D-glucopyranosid -e），其结构式见Fig.1。化合物11：黄色粉末（MeOH），m.p.190-192. 盐酸-镁粉及Molisch反应均为阳性，示为黄酮苷类化合物，1H-NMR (600MHz, pyridine-d5)， 6.16(1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.36(1H, d, J = 2.0 Hz, H-8)，7.96(2H, d, J=8.4 Hz, H-2, H-6), 6.88(2H, d, J=8.4 Hz, H-3, H-5)，6.79(2H, d, J=8.4 Hz, H-3, H-5)，7.45(2H, d, J=8.4 Hz, H-2, H-6), 6.79(2H, d, J=8.5 Hz, H-3, H-5)，7.55(2H, d, J=8.5 Hz, H-2, H-6)。其碳谱数据归属见Table 2，与文献14中山柰酚-3-O-(6,- 双-反式-对-香豆酰基)- -D-葡萄吡喃糖苷的谱学数据对照相一致，鉴定其为山柰酚-3-O-(6,- 双-反式-对-香豆酰基)-D-葡萄吡喃糖苷（kaempferol-3-O-6,2-di-O-(E)-p-coumaroyl -D-glucopyranoside），其结构式见Fig.1。化合物12：无色油状物。ESI m/z: 269.3M+Na+, IR(KBr cm-1):3296, 2961, 2874, 1742, 1465,1384, 1385, 1176, 1106, 1062; 1H-NMR(CDCl3, 300 MHz)，: 0.93(6H, m, CH32), 1.40(4H, m, CH22), 1.65(4H, m, CH22), 4.11(2H, t, J = 6.6 Hz, 1-CH2), 4.21(2H, m, 1-CH2), 2.83(2H, m, 1H-3); 13C-NMR（CDCl3，75 MHz），: 173.4(C-1) 、67.2(C-2)、38.7(C-3)、170.5(C-4) 、65.7(C-1) 、30.4(C-2)、18.9(C-3)、13.5(C-4)、64.8(C-1) 、30.4(C-2) 、18.9(C-3)、13.5(C-4)。与文献15报道的2-羟基-丁二酸二丁酯的谱学数据相一致，故鉴定该化合物为2-羟基-丁二酸二丁酯(2-hydroxy-1,4-dibutylbutanedioate)。化合物13：黄色粉末（MeOH），m.p. 312-315. 1H-NMR(DMSO, 300 MHz)，:12.48(1H, s, 5-OH), 10.78(1H, s, 7-OH), 9.58(1H, s, 4-OH), 9.36(2H, br.s, 3,3-OH), 6.17(1H, d J = 2.1 Hz, H-6), 6.39(1H, d J = 2.1 Hz, H-8), 6.87(1H, d J = 8.7 Hz, H-5), 7.53(1H, dd J = 8.7, 2.1 Hz, H-6), 8.30(1H, br.s, H-2)。数据与文献报道的槲皮素16的谱学数据相一致，故鉴定其为槲皮素(quercetin)。化合物14：橙黄色针状结晶（MeOH），m.p.256-257。1H-NMR(300MHz, DMSO)，:12.07（1H, s, 1-OH）,12.00(1H, s, 8-OH), 2.40（1H, s, CH3）, 6.59（1H，dd, J=2.5, 0.4Hz, 2-H）, 7.12(1H, dd, J=2.3, 0.4Hz, 4-H)，7.48 (1H, m, 5-H), 7.10(1H, m, 7-H) ; 13C-NMR(DMSO,75MHz), :164.6(C-1), 108.0(C-2), 165.7(C-3), 108.9(C-4), 120.6(C-5), 148.4(C-6), 124.2(C-7), 161.5(C-8), 189.8(C-9), 181.5(C-10), 132.9(C-4a), 113.5(C-8a), 109.0(C-9a), 135.21(C-10a), 21.6(CH3)，其核磁数据与文献大黄素的谱学数据17基本一致，鉴定其为大黄素（emodin）。化合物15：无色油状物（氯仿）。ESI-MS: 343M-H-, 367M+Na+, 345M+H+, 确定分子量为344。1H-NMR(CDCl3, 600 MHz) 3.95 (6H, s)为2个甲氧基质子信号，6.99-6.80(6H, m)为六个芳香质子信号，示结构中有两个苯环，1.05 (3H, d, J = 6.3 Hz, 3-CH3), 0.67 (3H, d, J = 6.6 Hz, 4-CH3) ，5.60 (1H, d, J = 3.9 Hz, H-5), 4.60 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-2)。其碳谱数据见Table 2。结构中的呋喃环上取代基的相对构型用NOESY谱进行了验证，观察到了两个甲基:0.67 (4-CH3), 1.05 (3-CH3)和:4.60(H-2)之间的NOE相关峰，而与H-5没有NOE效应，可以推测这2个甲基和这位氢质子位于同侧，经查阅文献，和文献报道的3,3-dimethoxylarreatricin 的谱学数据18相一致，鉴定该其为3,3-dimethoxyl arrea tricin，其结构式见Fig.1。化合物16：白色针状结晶（MeOH），m.p. 200-202. 溴酚蓝显黄色，示有羧基，FeCl3显色反应呈阳性，示有酚羟基。与原儿茶酸标准品共薄层，薄层行为完全一致，确定该化合物为原儿茶酸(3,4-Dihydroxybenzoic acid)。化合物17：白色粉末（CHCl3），m.p. 283-287. 10%硫酸乙醇溶液显紫红色；与已知对照品乌索酸经HPLC及薄层检测，色谱行为完全一致，鉴定其为乌索酸(ursolic acid)。化合物18：黄色粉末（MeOH），盐酸镁粉反应阳性，示为黄酮类化合物，与同植物中分离鉴定的山柰酚共薄层检测，薄层行为完全一致，确定其为山柰酚(kaempferol)。Fig.1 The structures of compounds 8,10,11,15Table 2. 13C-NMR Spectral Data of Compounds 8, 10，11 and 15 No.815No.1011285.584.82157.8156.5346.947.03135.0133.2447.648.94178.7177.2587.585.05162.8161.21136.6136.5699.998.82110.4112.47166.0164.33148.7145.3894.793.84145.7145.99157.7156.45112.3115.510105.2103.96118.0117.81121.9120.01133.2134.02, 6131.9130.92109.4110.23, 5116.1115.23147.7145.34161.8160.24146.0146.51104.198.35110.8110.4276.073.96117.8117.5378.473.93-CH311.911.9471.370.24-CH39.49.5576.074.43,3-OCH356.056.0664.262.84,4-OCH356.01126.1125.02, 6130.8130.33, 5116.8115.94161.4159.97145.2144.88114.9113.79167.3166.21125.22,6130.43,5115.94160.17145.28114.39165.9REFERENCES1 赵德义, 高文海, 花成文等. 板栗壳化学成分的初步研究J. 陕西林业科技, 2003, 47(2) ：1-3.2 吴龙云,凌桂生,许学健等.板栗毛壳的抗菌活性成分J.中草药,1991,22(8):370.3 杨晓燕, 陈发奎, 吴立军.石菖蒲水煎液化学成分的研究J. 中草药, 1998, 29(11)：730-731 .4