实验八 微生物发酵实验.doc

葡萄酒、泡菜、酸奶、啤酒实验生05 边晔 2010030026周四班 同组成员：徐竞 实验时间 2012年10月，11月一、 实验目的1. 了解固定化细胞技术的方法和意义；2. 了解酵母发酵产生啤酒、葡萄酒的过程；3. 学习酸奶和泡菜的制作方法；4. 了解纯种发酵和传统发酵在无菌操作方面的差别。二、 实验原理1. 葡萄酒葡萄酒是通过在葡萄汁中加入酵母发酵而得的，具体的过程是酵母把葡萄汁里的糖分分解成酒精和二氧化碳，还有一些有利于酵母生长的其他物质，如酯类。酵母从何而来，我们平常留意一下所吃的水果葡萄的皮表面，就发现有一层白色的像霜一样的东西，也像蜡，其主要成分是油酸，有细菌在上面生长，这种细菌，就是野生的天然酵母。在葡萄被破皮、混合、压榨后，有部分的天然酵母被溶到果汁中，有合适的温度，就会发酵。这部分天然酵母其实有很多类型，各具特点，有的能耐发酵的高温，有的能分离出鲜明的果香。2. 泡菜泡菜中有丰富的活性乳酸菌，它可抑制肠道中腐败菌的生长，减弱腐败菌在肠道的产毒作用，并有帮助消化、防止便秘、防止细胞老化、降低胆固醇、抗肿瘤等作用；泡菜中的辣椒，蒜、姜、葱等刺激性作料可起到杀菌，促进消化酶分泌的作用。3. 啤酒啤酒生产过程：分为麦芽制造、麦芽汁制造、前发酵、后发酵、过滤灭菌、包装等几道工序。固定化技术：就是将生物酶或细胞固定在一定的基质上，比之传统的方法，具有能多次使用菌体的特点。包埋法：固定化技术的一种。是将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体紧密结构中，细胞不易漏出。由于在制定固定化细胞时，细胞和载体不起任何反映，细胞处于最佳生理状态；同时固定化细胞有载体为屏障，可避免外界不利因素的影响，因此能迅速增殖，结果单位体积内的酵母数比通常液体培养的高。增殖酵母凝集在凝胶表面形成浓厚的菌体层，因此酵母能迅速与基质接触，从而缩短周期，提高啤酒的产量。4. 酸奶新鲜酸奶里含有大量的乳酸菌（每ml含40亿活菌以上），可以使肠胃中的有益菌增加，抑制有害菌成长，降低毒素产生的机会，有利于改善便秘现象，因此能强化肠胃消化吸收功能。本次实验中使用电磁炉加热和用成品酸奶作为菌源来来制作酸奶。三、 实验仪器、材料和用具食盐，糖，姜，辣椒，水萝卜，胡萝卜，大白菜，莴笋，泡菜坛子；啤酒酵母，100ml麦芽汁(8%10%)，2.5%海藻酸钠溶液5ml，1.5% CaCl250ml，0.9%生理盐水50ml，灭菌；市售三元鲜牛奶，酸奶，糖，一次性塑料杯。新鲜葡萄若干，搅拌机，纱布。无菌滴管；无菌玻璃棒；无菌封口膜封好的100ml三角瓶；冰箱；恒温培养箱；电磁炉（含锅和勺子）；吸管若干支。四、 实验步骤1. 泡菜制作将蔬菜洗净切好后放入泡菜坛中，加入盐3、6%，糖3、6、9%的凉白开水溶液，高浓度盐水封盖口（每2天检查水位）室温发酵2周，品尝。2. 酸奶制作直接往经过巴氏消毒的市售三元牛奶中加入约6%(w/v)白糖，加热到70-80 到溶解后，冷却到45 以下不烫手后加入约5%市面上销售的三元酸奶，摇匀，分装到纸杯。用洁净的白纸将纸杯口盖住，42进行发酵培养12小时。置于冰箱或冰水中数小时，待冷却老熟后便成酸奶，品尝。3. 啤酒制作菌体培养：将培养24h 的新鲜斜面菌种，接种于三角瓶中培养；细胞固定化：在5mL海藻酸钠溶液中，加入2ml 预热至35的酵母培养液,混合均匀，以无菌滴管吸取混合液，滴管口离液面5cm以上，缓慢而稳定滴加到CaCl2溶液中，即可得到直径约3mm左右的凝胶珠；全部滴入，钙化30min；装瓶和发酵：在无菌玻璃棒帮助下倒掉CaCl2 溶液，倒生理盐水于制得的固定化好的酵母细胞的瓶子中，洗一次凝胶珠，将100mL发酵培养基（麦芽汁）倒入制得的固定化小球的瓶子中，25静止培养36小时；放置4 冰箱中保存。品尝：观察瓶中是否有霉菌，是否有酸味或其他怪味。4. 葡萄酒制作在尽量无菌条件下，将各种新鲜成熟的酿酒葡萄样品去除青籽及腐烂籽，去梗及搅拌机破碎。葡萄取200 mL葡萄浆置于无菌三角瓶（开水烫洗）中，使糖含量160-220 g/L，并将剩余的葡萄皮及葡萄籽加入其中，随后加入亚硫酸使其有效的SO2含量为60 mg/L抑制杂菌生长，调节pH为3.6，混匀，用封口膜密封，置室温下自然发酵。一共有6个三角瓶。一部分的葡萄浆中使用的是白葡萄，一部分使用的是带皮的红葡萄。6个三角瓶分别是：1号瓶（糖和酵母）均含有的葡萄浆。2号瓶加入糖3,4,5号瓶不加糖6号瓶是仅仅含有酵母的对照组。两天进行一次拍照和称重。到重量稳定时可以停止发酵，用4-6层新纱布过滤即可饮用。五、 实验结果与讨论1. 泡菜图1 泡菜照片可能是发酵时间比较长，个人感觉还是很酸的（我对酸不太耐受）。整体颜色很鲜艳，萝卜有些发软，口感不是太好。白菜还是较脆的，还有一点辣味。不同盐浓度的差别明显，6%的明显咸了。糖的浓度还是高一点的味道更好。气味很冲，我把泡菜打包在塑料袋中，不论走到哪都能闻到一股泡菜味。拿到家，父母也表示发大发了，酸味太冲。当时看到有很多泡菜没吃完就倒掉了，感觉还是有点浪费的。2. 葡萄酒表一 葡萄酒称重编号10月25日10月29日11月2日11月4日1号瓶（糖和酵母）179.9650g170.7056g168.3974g168.2864g2号瓶（糖）195.6177g195.3408g194.5382g194.1452g3号瓶192.7079g191.9525g190.8548g186.2261g4号瓶182.1454g181.3368g180.3081g179.8698g5号瓶176.2012g175.6032g174.8652g174.5626g6号瓶（对照组）188.5178g181.7948g181.5332g181.4569图2 11月2日葡萄酒拍照图3 11月4日葡萄酒拍照注：网络学堂只见两张照片图4葡萄酒重量变化曲线分析：由上图可以看出，随着发酵时间的增加，葡萄酒的整体重量呈下降趋势。这是因为葡萄糖厌氧发酵产生乙醇和二氧化碳，而后者作为气体溢出，导致整瓶质量下降。由于发酵过程中没有补充营养物质，所以随着发酵的进行，糖不断被消耗，使得酵母生长代谢变慢，最后趋于平缓。随着糖分的耗尽，发酵停止，总重量基本不变。对比各个曲线可以看出，2号瓶（加糖）的发酵期相对更长，但由于整体发酵速度较慢而曲线斜率不大，所以看起来不好区分。但从理论上来讲，糖的含量越多，发酵的时间应该越长，而最后酒精的含量也就越多，酒味越浓，而结果确实如此。可以设想，如果发酵时间再延长几天，区别会更加明显。1号瓶（加糖和酵母）与其它几条曲线有明显区别，刚开始的时候发酵速度很快，曲线斜率较大。这应该是因为加了酵母的缘故，于是有更多的微生物进行厌氧发酵，发酵速度较快。理论上讲，1号瓶不仅发酵底物多，而且发酵速度快，所以乙醇应该最多，酒味最浓。1号瓶酒味最浓，2号瓶次之，其它瓶不怎么香醇。3. 啤酒这次啤酒没有其它异味，说明基本没被杂菌污染。啤酒成红褐色，应该是原来加的麦芽汁的颜色，但已经没有那么红。猜想如果再多发酵几天，颜色会更浅，变成黄色，酒味也会更醇厚。液体表面有气泡，应该是发酵产生二氧化碳的缘故。图5 固定化酵母发酵啤酒照片4. 酸奶图6 酸奶照片这几个发酵实验个人感觉最好吃的就是它了。光是那纯白的颜色就让人心净无杂念。总之就是很干净，没有那么多杂质，而且口感滑溜溜的，酸味甜味相得益彰。这种制作酸奶的方法非常大众化，简单易行。可以自己在家里搞定，但要注意杂菌问题。六、 思考题1. 固定化细胞技术的意义固定化细胞技术的优点有保持细胞生理活性、提高接触面积和效率、易于分离产品、可回收再利用等。固定化细胞的应用范围极广，目前已遍及工业、医学、制药、化学分析、环境保护、能源开发等多种领域。在工业方面，如利用产葡萄糖异构酶的固定化细胞生产果葡糖浆；将糖化酶与含淀粉酶的细菌、霉菌或酵母细胞一起共固定，可以直接将淀粉转化成葡萄糖；利用涨澡酸钙或卡拉胶包埋酵母菌，通过批式或连续发酵方式生产啤酒；利用固定化酵母细胞生产酒精或葡萄酒；此外，还可利用固定化细胞大量生产氨基酸、有机酸、抗生素、生化药物和甾体激素等发酵产品。在医学方面，如将固定化的胰岛细胞制成微囊，能治疗糖尿病；用固定化细胞制成的生物传感器可用于医疗诊断。在化学分析方面，可制成各种固定化细胞传感器，除上述医疗诊断外，还可测定醋酸、乙醇、谷氨酸、氨和等。此外，固定化细胞在环境保护、产能和生化研究等领域都有着重要的应用。此技术适用于世代时间长的微生物，抵抗外界不良环境的能力增强，增加了生物量，停留时间短，容积负荷高，速率。2. 纯种发酵和传统发酵在无菌操作方面的差别?传统发酵是以成分复杂的谷物为原料，有多种微生物分泌的酶系参与，水解与发酵混合进行，将原料成分转化成多种风味和营养物质。它适用于产品成分复杂，风味要求高的传统发酵食品，如酿造白酒、黄酒、食醋、酱油、豆酱、豆豉、腐乳等的生产。多种微生物、酶系主要来源于制曲，其次是在开放发酵的条件下，由环境中进入。在制曲过程中，自然存在的多种微生物，进入曲料中竞争生存，能适应制曲环境的保存下来，生长繁殖，积累了丰富的代谢产物和种类繁多的酶系。在开放发酵条件下，大量的微生物进入发酵醪（醅）中，适者生存，与曲中的微生物互生、交替、平衡、制约、酶系互补，代谢产生多种风味和营养物质。不同的微生物有不同的代谢途径，代谢产物各不相同。多种微生物协同作用能优势互补，相辅相成能起到单一菌株起不到的作用。纯种发酵是在成分单一的发酵基质中，仅接入一种微生物，通过对该微生物的培养，得到纯度较高的单一性产物。纯种发酵使用单一的微生物，参与生化反应的酶系不多，代谢产物较少，适宜生产成分单一，纯度较高。在无菌操作方面，传统发酵对无菌操作要求较低。主要通过最初的灭菌和引入曲种后优势菌对其他杂菌的抑制来避免杂菌的入侵。而且，在开放的发酵条件下，微生物进入发酵醪（醅）中，适者生存，与曲中的微生物互生、交替、平衡、制约、酶系互补，代谢，为产品增添了风味和营养物质。而纯种发酵必须保持发酵的始终单菌纯种，要求人工扩大的菌种不得被污染，一旦发现其它菌株出现，便称之为发酵事故。因而对发酵设备和环境要求较高，要有严格的灭菌措施和空气净化系统。3. 为何有的同学无法制得凝胶珠而得到无规则的固体？有可能该同学滴加液体的速度过快，又没有注意移动滴管口使下落液滴均匀分布，导致液滴相互连接形成不规则的固体。另外，凝固主要靠海藻酸钠和钙离子发生发应形成海藻酸钙凝胶颗粒。如果滴加高度不够，液珠没有充足的速度来冲击进入氯化钙溶液，就不能在凝固前保持足够长时间完整的球形，而会散成不规则形状。也可能是因为在滴加时液滴没有直接滴入溶液内，而是挂/沾在瓶壁上，这样再落入水中时形状就不能形成球形了，从而最终形成无规则的固体。4. 为何选择无抗奶作为酸奶发酵原料？无抗奶是指不含抗生素的奶。我们是用市售酸奶中的乳酸菌做为菌种来发酵牛奶，如果牛奶中含有抗生素，就会抑制乳酸菌生长，达不到发酵的目的。另外，相对于有抗奶而言，无抗奶更安全健康，不会使人产生对抗生素的过敏反应和抗药性。七、 实验总结本实验