微生物壳聚糖酶的研究进展及其应用现状.doc

微生物壳聚糖酶的研究进展及应用现状赵华 任晶（天津科技大学生物工程学院，天津 300222）摘要：壳聚糖是自然界中最丰富的多糖之一。壳聚糖酶是以内切方式催化水解部分乙酰化壳聚糖中的-1，4-氨基葡萄糖苷键的酶，其催化产物壳寡糖具有多种生物学特性，在改善肠道微生物的菌群分布、调节植物生长,抑制肿瘤等方面有很好的效果。而且我国有储量丰富的壳聚糖资源，有利于壳寡糖的大规模生产。本文从壳聚糖酶的来源及性质、产生、分离纯化，固定化等方面进行了综述，并从食品、农业、医疗卫生等领域展示了壳寡糖的应用现状，展望了壳聚糖酶的发展前景。关键词：壳聚糖酶，壳聚糖，研究，应用Present situation of research and application for microbiolgical chitosanases Zhao Hua, Ren Jing(College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300222,PRChina)Abstract: Chitosan is one of the most abundant polysaccharide in nature .Chitosanases catalyze the hydrolytic breaking of its glucosidic bond and produce chitosan,which are widely applied for various purposes in medicine, agriculture,food and industry. For example, in improving the intestinal microbial bacteria group distribution, regulation of plant growth, Inhibition of tumor and so have very good results. And China has abundant reserves of chitosan which conducive to large-scale production of chitosan oligosaccharide.In this paper, the source,nature,purification, immobilization studies of chitosanase were reviewed.From food, agriculture, medical and health fields, the application shows the status of chitosan oligosaccharide and looking forward to the development of chitosanase.Keywords:chitosanase ,chitosan, research,applictio壳聚糖(Chitosan,简称CTS)学名为聚(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，是甲壳素脱乙酰化而得到的一种生物高分子，是目前唯一商品化的碱性多糖。由于壳聚糖具有无毒、可被生物降解、良好的生物容性和成膜性等优良特性，因此在农业、医疗卫生等方面有广泛的用途1。但是壳聚糖的分子量大，水溶性较差，在人体内不易吸收，使其应用受到限制。近年来研究发现壳聚糖的降解产物壳寡糖（Chiooligosaccharides）具有独特的生理功能，如抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿等显著特点，使其有着更为广阔的应用前景1,2。酶法制备壳寡糖由于具有条件温和、无污染，酶解产物较易控制等优点，成为当前甲壳素学科中最重要的一个分枝。综述了国内外产壳聚糖酶的微生物的研究和应用现状。1壳聚糖酶的来源及其性质1.1壳聚糖酶的发现1973年，Monaghan等3在研究用水解酶对抗病原真菌的可能性时，发现一种不同于几丁质酶的新酶，这种酶对胶态几丁质不水解，但是能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖，所以它被认为是对线性的壳聚糖具有水解专一性的一种酶，并于1984年向国际酶学委员会申请登记编号-EC3.2.1.99。此后，经过将近30年的一系列的研究，人们又相继从多种微生物（包括细菌、放线菌、真菌以及病毒等）及单子叶和双子叶植物的不同组织中发现壳聚糖酶的存在。2004年，国际酶学委员会将壳聚糖酶重新定义为：以内切方式催化水解部分乙酞化壳聚糖中的-1，4氨基葡萄糖苷键的酶。1.2壳聚糖酶的分类根据壳聚糖酶的作用方式的不同，壳聚糖酶可以分为两类：内切型和外切型。内切酶是随机切断壳聚糖链，产生分子量较小的低聚糖，这也正是适合制备壳低聚糖的酶。外切酶则是从糖链的非还原性末端逐个切下单糖体残基。文献报道大部分壳聚糖酶为内切型壳聚糖酶，但也发现少部分微生物如Aspergillus fumigatus KH-944、Nocardia orientalisIF0128065既产内切酶又产外切酶。根据酶作用底物糖苷键的类型，壳聚糖酶被分为3类：作用GlcN-GlcN和GlcNAc-GlcN的为类；只作用 GlcN-GlcN的为类；作用 GlcN-GlcN和 GlcN-GlcNAc的为类。 其代表菌株分别为Fukamizo等6,7人报道的来自于Bacillus pumilus BN-262和Streptomyces sp N174；Bacillus sp.No.7-M8壳聚糖酶；S.griseus HUT 60379和B.circulans MH-K110壳聚糖酶。1.3壳聚糖酶的理化性质壳聚糖酶的分子量在2350KD之间，一般从微生物中分离得到的看见分子量为2040KD。但也存在少数高分子量的壳聚糖酶，如曲霉Aspergillus fumigatus KH-94有两种壳聚糖酶，其中一种酶的分子量为108KD11。壳聚糖酶大部分为碱性蛋白，等电点在4.010.1之间，最适pH为4.08.0，Bacillus circulans WL-12的壳聚糖酶的最适为pH9.512。而且Myxobacter AL-1的壳聚糖酶有两个最适pH分别为5.0和6.8。多数微生物的壳聚糖酶具有很好的热稳定性，最适反应温度在3060之间。Bacillus sp.strain CK 4 13的壳聚糖酶的耐热性很高，60处理30min仍然能保持全部酶活性，80处理30min和60min后酶才完全失活。大多数的细菌和真菌都将壳聚糖酶分泌到胞外，胞内型的壳聚糖酶主要存在与植物和结合真菌中。壳聚糖酶既有诱导型也有组成型，大多数属于诱导型。不同生物中壳聚糖酶的水解动力模式也不同，这取决与底物的脱乙酰化程度。文献中报道的壳聚糖酶大多数是内切型酶，即其水解产物是壳寡糖的混合物，聚合度210不等。2壳聚糖酶的产生、分离纯化及其固定化2.1壳聚糖酶的产生目前研究的大多数微生物来源的壳聚糖酶属于诱导酶，一般以壳聚糖为诱导物它们的降解产物为阻遏物，因此当以壳聚糖作为唯一碳源时, 微生物的产壳聚糖酶的能力就能被诱导出来。根据此理论, 筛选产壳聚糖酶微生物多采用“透明圈平板法”：即采用以壳聚糖为唯一碳源和氮源的固体培养基平板进行富集培养, 限制大多数不能利用壳聚糖的微生物生长, 而能产生壳聚糖酶的微生物由于能利用壳聚糖的降解产物进行生长繁殖。由于壳聚糖被微生物降解, 于是在白色不透明胶体壳聚糖平板上能够产壳聚糖酶的微生物的菌落周围就会形成一个透明圈, 通过比较透明圈直径和菌落直径的比值, 就可以初步定量的确定产壳聚糖酶活力的大小。由于天然菌株产壳聚糖酶的能力一般较低, 现在大多都使用诱变育种。2.2壳聚糖酶的分离纯化目前,国内外在微生物产壳聚糖酶的分离纯化上已做了大量的研究。韩宝芹等14对自筛菌株YJ02产的壳聚糖酶进行了纯化：发酵液经离心去菌体、(NH4)2SO4盐析、Q-Sepharose FastFlow阴离子交换、SephacrylS-100凝胶过滤后, SDS电泳显示只有1条带，酶的分子质量为66200u，纯化倍数为28.9倍，收率为47.6%。Aktuganov等15对Bacillussp. 739产的壳聚糖酶进行了分离纯化研究:发酵液经离心、(NH4)2SO4盐析、DEAE-SephadexA-50阳离子交换层析后,活性蛋白在SDS上仅呈1条带，酶分子质量为46000u。孙菲等16对菌株JH01产的壳聚糖酶进行了分离纯化：发酵液经抽滤、浓缩、DEAE Cellulose 52离子交换层析后，在SDS上只有1条蛋白质谱带，分子质量是30000 u，酶回收率为66. 3%，纯化倍数为11. 70倍。2.3壳聚糖酶的固定化由于大多数微生物产壳聚糖酶的活性低，在生产过程中酶活损失大，因此造成壳寡糖生产成本相对较高，影响壳聚糖酶的工业应用。经过固定化后的壳聚糖酶其稳定性得到了提高，并可循环使用，在壳聚糖酶的研究中，固定化是一个重要的方向。潘晓榕等17采用吸附交联法对假单胞菌（Pseudomonas）CUY8产壳聚糖酶固定时，最佳pH值为4.0，最佳温度65，米氏常数为14.71mg/ml半衰期为45d；采用包埋法活得的壳聚糖酶的最佳pH值为5.5，最佳温度35, 米氏常数为5.91mg/ml半衰期为37d.。固定后的壳聚糖酶较游离酶相比有明显优势。段彬等18固定化细胞产酶的研究结果表明，多孔玻璃可以有效吸附无花果沙雷氏菌(Serrratia.ficaria CH-0203)菌细胞，在最适发酵条件下（pH 6.5，培养基与载体的总体积48mL，载体与培养基的比例为1.5g/4.0mL，吸附时间是2026h），发酵液酶活达到4.5 U/mL，比游离细胞发酵提高了16；采用半连续发酵的方式，固定化的细胞可以稳定发酵产酶120 h左右。固定化细胞产酶的效率大大高于游离细胞。3壳聚糖酶降解产物壳寡糖的应用壳聚糖酶是降解壳聚糖的专一性酶,将壳聚糖降解为低分子量的壳寡糖，即由210个氨基葡萄糖通过-1, 4-糖苷键连接而成的低聚糖。壳寡糖以其独特的生物学功能，在食品、农业、医药等领域有着广泛的用途。3.1壳寡糖在食品工业中的应用壳寡糖可作为人体肠道的微生态调节剂，服用壳寡糖能使肠道内的双歧杆菌、乳杆菌等有益军的数量明显增高；壳寡糖具有爽口的甜味，不易被体内消化液吸收，具有很好的保湿性和耐热性，几乎不产生热量，是糖尿病人理想的功能性甜味剂；壳寡糖还具有很好的防腐性，可作为食品防腐剂；由于低聚壳聚糖有许多亲水的游离胺基及羟基，对水有很高的亲和力和持水性，因此可永固果蔬的保鲜，起到保湿，增湿和防腐的作用。3.2壳寡糖在农业中的应用在农业生产中，壳寡糖可以诱导植物产生光谱抗性，增强植物自身的防卫能力。抑制多种病源微生物的生长；还可以作为新型植物生长调节剂，促进植物生长，提高发芽率和抗病性。Hzdwiger和Beckman研究发现，豌豆的内果皮内含有的壳聚糖酶能够降解F.solani.f.sp.pisi和F.solani.f.sp.phaseoli的细胞壁生成壳聚糖和壳寡糖，对F.solani.f.sp.pisi和F.solani.f.sp.phaseoli具有杀菌作用，并且还可以作为激发子，诱导植物产生植保素19。裘迪红等20的研究发现，用低聚壳聚糖处理水稻、玉米，出芽率和产量都明显上升。用壳聚糖处理冬小麦种子，可增产5%30%，品质也有提高，如蛋白质增加3.36%，湿面筋增加21.5%，干面筋增加20%。3.3壳寡糖在医药领域中的应用在医药方面，小分子壳寡糖具有优良的抗肿瘤活性，特别是六聚糖具有很强的抑制肿瘤的作用21。官杰等22以荷瘤小鼠为动物模型进行体内试验，发现质量分数为1.5%20COS可明显抑制实体瘤的生长，抑制率达47.17%，COS对肺癌细胞的抑制效果更加明显，体外抑瘤率平均达76%。壳寡糖还有降胆固醇作用23；Liao等24通过60名志愿者8周的试验观察发现,在水溶性壳聚糖组(相对分子质量为3000050000)总胆固醇下降了7.5%，在水不溶性壳聚糖组(相对分子质量为100 000150 000)总胆固醇下降了8.9%；血清中低密度脂蛋白(LDL)分别下降了10%和6%。研究发现，几丁质、壳聚糖及其寡糖具有三调（免疫调节、调节pH、调节激素分泌）、三降（降血脂、降血糖、降血压）、三排（排胆固醇、排重金属离子、排毒素）、三抑（抑制癌细胞生长、抑制癌细胞转移、抑制癌毒素产生）的功能25。此外，壳寡糖还有提高动物机体抗病菌感染的作用，已经发现其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抗菌活性26。4国内外对壳聚糖酶的研究现状国内对壳聚糖酶的研究处于起步阶段，在筛选产壳聚糖酶的微生物菌种方面做了大量工作，近几年开始转入分子生物学阶段并对酶的动力学性质和酶解作用模式和酶解产物的组成等理论进行研究。起初从土壤中筛选得到的微生物产壳聚糖酶的活力普遍较低，纯品酶活一般都在525U/mg之间，参率一般在1.277%。目前比较高的酶活力有：中国海洋大学27将本实验室保藏的产壳聚糖菌株P003进行复壮，产酶条件优化最后得到的发酵液中壳聚糖酶活力达到108U/ml。Sun Yuying28首次从土壤中筛选得到一株高产壳聚糖酶的微杆菌属（Microbacterium）在最适产酶培养条件下发酵液中壳聚糖酶活力可达118U/ml，是目前所见报道中产壳聚糖酶活力最高的微生物菌株，并且利用分子生物学手段实现了该菌株在大肠杆菌体内的重组表达，最终获得了具有生物活性的重组蛋白。国外关于壳聚糖酶的性质研究逐渐从对酶的分离纯化发展到在分子水平上研究产酶基因和酶蛋白的一些特性。从目前情况看来，研究的最为深入的是放线菌属Streptomyces N174,对其三级结构，活性中心基因都进行了研究，另外，已知三级结构的有Bacillus circulans MH-K1。5 展望 我国有储量丰富的壳聚糖资源，而且其降解产物壳寡糖的应用范围非常广泛。目前多采用化学降解法生产壳寡糖,对环境污染严重，产率不高。采用特异性的壳聚糖酶进行酶法降解壳聚糖制备壳寡糖不仅具有高效、产物质量好等优点，同时还可以降低环境污染。因此寻找新的专一高活性的壳聚糖酶来源，利用基因工程或诱变手段提高现有壳聚糖酶产量具有重要的意义。随着研究的深入，人们将会对壳聚糖酶有更加深入的认识，从而带来更大的经济和社会效益。参考文献1 Jeon YJ, Park P T, Kim S K. 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