蛋白质分离纯化方法概述（刘）.doc

目录摘 要2Abstract31 蛋白质42 蛋白质的预处理43 蛋白质分离纯化的方法及原理53.1 根据蛋白质溶解度不同而进行分离提纯53.1.1 蛋白质的盐溶和盐析53.1.2 等电点沉淀和pH值调节63.1.3 有机溶剂沉淀法63.1.4 双水相萃取法和反胶团萃取法73.2 根据蛋白质电荷不同而进行分离纯化73.2.1 电泳法73.2.2 离子交换层析83.3 根据蛋白质分子大小不同而进行分离纯化93.3.1 透析法和超滤法93.3.2 离心法93.3.3 凝胶过滤103.4 利用蛋白质对配体的特异亲和力而进行分离纯化103.5 根据选择性吸附性不同而进行分离纯化113.5.1 羟磷灰石层析113.5.2 疏水作用层析113.6 色谱法113.6.1 反相高效液相色谱法113.6.2 正交轴逆流色谱法113.6.3 微乳液毛细管电动色谱分离法(MEEKC)123.7 蛋白质分离纯化新技术简介123.7.1 微流控芯片技术123.7.2 联用技术124 展望13参考文献14蛋白质分离纯化方法概述摘要：蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点之一。文章主要对蛋白质的分离纯化的各种原理和方法作了简要的概述,根据蛋白质分子的溶解度、分子大小、带电性质、选择性吸附、配体特异性等性质分类总结了蛋白质纯化的方法及其研究进展，并且简述了几种色谱法和新技术，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。关键词：蛋白质，预处理，分离纯化，方法The Overview of Separation and Purification for ProteinAbstract：The method of separation and purification for protein is one of the hotspots of the field for life scienceIn this paper，it summarized the various principles and methods of protein separation and purificationAccording to the solubility of protein molecules，molecular size，charged nature-selective adsorption，and ligand specificity，protein pufification method and research progress were summarized，and some kinds of methods of chromatography and new technolodies were described,which was designed to provide theory support for carrying out the protein preparation and application researchKey words：protein，pretreatment ,separation and purification，methods蛋白质是生物体细胞的重要组成成分，是自然界中最重要的几种生物大分子之一。蛋白质还参与基因表达的调节，以及细胞中氧化还原、电子传递、神经传递乃至学习和记忆等多种生命活动过程。在细胞和生物体内各种生物化学反应中起催化作用的酶主要也是蛋白质。因此，蛋白质是生命科学中极为重要的研究对象，研究蛋白质对了解生命规律、指导工业生产、医药实践有着重大的理论与实践意义，而蛋白质的分离纯化是蛋白质研究中必不可少的一个环节。蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性功能等特性不同，为蛋白质的分离纯化提供了多种方法。我们针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述，为今后的理论和应用研究提供依据。【】1 蛋白质【】蛋白质是是一种复杂的生物大分子，相对分子质量在1万至几百万之间，其组成单位是氨基酸。酶、抗体、血红蛋白、肌红蛋白、生物膜蛋白以及某些激素等都是蛋白质。蛋白质是具有特定构象的大分子，只有当蛋白质以特定的适当空间构象存在时才具有生物活性。蛋白质是两性电解质，在蛋白质内部和表面都有电离点和疏水点。酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸具有紫外吸收特性，在280nm处有最大吸收值，大多数蛋白质都具有这些氨基酸，所以蛋白质在280nm处有特征吸收，这是紫外吸收法定量测定蛋白质的基础。蛋白质在酸、碱或酶的作用下，完全水解的最终产物是侧链结构和性质各不相同的-氨基酸，通常为22中基本氨基酸中的十几种。这些-氨基酸以肽键（酰胺键）相连结形成多达几百个氨基酸残基的大分子化合物（蛋白质），类似结构的较小分子称为多肽（polypeptide）。尽管组成蛋白质的基本氨基酸种类有限，但由于氨基酸连结的顺序和比例不同，又可形成不同的三维空间结构，从而形成性质不同和结构各异的成百上千种蛋白质。2 蛋白质的预处理分离纯化某一蛋白质首先要将蛋白质从原来的组织中释放出来，并且保持原有的天然状态，不丢失活性物质。因此，根据分离纯化的原料不同，要采取不同的方法进行预处理。例如，动物材料要去掉结缔和脂肪组织，植物组织和细菌要将细胞壁进行破碎。破碎主要采取超声波振荡、研磨、高压挤压或酶处理等方法。组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲溶液将目的蛋白质提取出来，细胞碎片等不溶物质用离心或者过滤的方法除去。近年来酶在蛋白质分离纯化中应用非常广泛。张玉香等【】在对酵母的甘露糖蛋白进行分离纯化时，利用酶将结合于细胞壁中的甘露糖蛋白释放出来。另外酶还被广泛应用于米渣、米粉和米糠的蛋白提纯【】。在对大米渣中蛋白质进行提取的过程中，先后用到了纤维素酶、-淀粉酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶，其中纤维素酶和-淀粉酶可对大米渣进行初步除杂提纯【】。李喜红等【】在对米糠中的蛋白质进行提纯前，在原料中加入了包含多种戊糖酶的酶复合物，实验条件为：加酶量0.90%，pH 值3.5，提取温度50 ，提取时间3.5 h。酶法还应用于鱼鳞中胶原蛋白的提取【】。一般条件下，碱性蛋白或碱性酶、肽在酸性环境下较碱性环境稳定，反之亦然。因此，利用酶对蛋白质进行预处理时，要选择合适的酶以及操作环境，以达到较好的提纯效果。3 蛋白质分离纯化的方法及原理3.1 根据蛋白质溶解度不同而进行分离提纯影响蛋白质溶解度的外部条件有很多，比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下，不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度，根据蛋白质分子结构的特点，适当地改变外部条件，就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度，达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有蛋白质的盐溶和盐析、等电点沉淀和pH值调节、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。3.1.1 蛋白质的盐溶和盐析 蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，此称盐溶；当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。一般粗抽提物常用该法进行粗分。 盐析沉淀法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。蛋白质易溶于水，因为其分子的-COOH、-NH 和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1100 nm大小的亲水胶体，从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。蛋白质分子表面亲水基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力就越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个，即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性，当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法，如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法，其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性，为防止其对蛋白质的破坏，应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子之间产生共沉淀现象，蛋白质样品的含量一般控制在02 20 。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后，通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐【】。3.1.2 等电点沉淀和pH值调节等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同的等电点来分离蛋白质的方法。蛋白质的等电点(pI)即蛋白质的净电荷为零时的pH值，由于等电点时的蛋白质净电荷为零，因而失去了水化膜和分子间的相斥作用，疏水性氨基酸残基暴露，蛋白质分子相互靠拢、聚集，最后形成沉淀析出。有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解，因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。王洪新等【】研究茶叶蛋白质提取过程发现，pH 值为4时茶叶蛋白提取效果最好，提取率达到36.8% ，初步纯化得率为91.0%。李殿宝【】在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到34，使目标蛋白于等电点沉淀出来。等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取。李凤英等【】测得葡萄籽蛋白质的等电点为3.8。他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质，得到了最佳的提取工艺为：以110 -5molL-1的NaOH溶液，按1：5的料液比，在40 搅拌40 min，葡萄籽蛋白质提取率达73.78% 。另外还可以利用碱法提取大米蛋白，其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取【】。利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白，蛋白质产率高达90%【】。3.1.3有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中便沉淀析出。由于在室温下，有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀，而且伴随着变性。因此，通常要将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高，蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质，可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取，它们有一定的亲水性和较强的亲脂性，是理想的提取液。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有机溶剂沉淀法。用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。常用于蛋白质和酶的提纯中。3.1.4双水相萃取法和反胶团萃取法萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法，而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction，ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相，由于被分离物在两相中分配的不同，便可实现分离，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行，双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性，收率较高。对于细胞内的蛋白质，需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩，细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白，受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响【】。反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。程世贤等【】就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质。3.2根据蛋白质电荷不同而进行分离纯化根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。3.2.1 电泳法在外电场的作用下，带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质混合样品经过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同而达到分离。常用聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，高效毛细管电泳等。聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，电泳颗粒通过网状结构的空隙时受到摩擦力的作用，摸擦力的大小与样品颗粒的大小呈正相关。可见样品蛋白质在电场作用下受到两种作用力，即静电引力和摩擦产生的阻力，因而大大提高了电泳的分辨能力。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS-PAGE)。可把蛋白质视为偶极离子，因此会在电场中迁移。SDSPAGE能有效地把不同类型的蛋白质分开的主要依。据，是各种物质分子量的差异性。因为当SDS与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷。与此同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。可以用已知蛋白质的分子量来校正电泳迁移率，因此可估测未知蛋白质分子的分子量。高效毛细管电泳。所谓毛细管电泳是在石英毛细管中进行电泳，毛细管中充满缓冲液或凝胶。与平板凝胶电泳相比，毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这主要是由于毛细管内径细，因此表面积与体积比大，易于扩散热量；另外电泳时电阻相对大，即使选用较高电压f可高至30kV)仍可维持较小的电流。毛细管电泳同茶馆内在高电场下进行，可以缩短分析时间，并且提高分辨率。3.2.2 离子交换层析以离子交换剂为固定相，液体为流动相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的层析方法称之为离子交换层析(Ion exchange chromatography，IEC)。离子交换层析中，基质由带有电荷的树脂或纤维素组成，其可分为阳离子柱和阴离子柱两大类，还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶树脂等。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。当蛋白质处于不同的pH值条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，被留在层析柱上，通过提高洗脱液中的盐浓度，将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来，其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH 值洗脱下来。李全宏等【】妇将离子交换层析应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯。另外，离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取，如赵荣乐等【】以DEAE-C52离子交换层析和Sephadex G50凝胶过滤成功地从盐源山蛭(Haemendipsa yunlyuanensis)头部分离纯化了抗凝血多肽，获得了蛋白质质量浓度为1.17 mg/mL，抗凝血酶比活性为152.78 Umg的抗凝血多肽。3.3根据蛋白质分子大小不同而进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质，并且不同蛋白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。3.3.1透析法和超滤法透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析法是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸人透析液进行分离的方法。超滤法是利用压力或离心力，使用一种特制的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜，也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。樊晶等【】应用萃取一超滤两步法从过期人血中提取人血红蛋白。3.3.2离心法3.3.2.1密度梯度(区带)离心。密度梯度(区带)离心是使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白，得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等【】通过比较不同密度梯度介质的分离效果，利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。3.3.2.2速率区带离心。速率区带法是一次分离不同类型聚合物最有效方法，是根据大小不同、形状不同的颗粒在梯度液中沉降速度不同建立起来的分离方法。离心前预先在离心管内装入密度梯度介质(如蔗糖、氯化铯)，被分离物质的样品溶液位于梯度液的上面，在离心力的作用下样品中的各组分以不同的沉降速度沉降，当颗粒的沉降速度与密度的浮力相等时，颗粒就停留在该密度区域内，使各组分达到分离的目的。如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。3.3.2.3差速离心法。差速离心是通过不断增加相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下进行多次离心的方法。差速离心一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。进行差速离心时，首先要选择好颗粒沉降所需要的离心力和离心时间。离心力过大或离心时间过长，容易导致大部分或全部颗粒沉降及颗粒被挤压损伤。3.3.3凝胶过滤凝胶过滤也称凝胶渗透层析，原理是混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离，在洗脱过程中，分子质量最大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。董转年等【】对天麻初提液两次超滤(3kDa和1kDa超滤膜)，凝胶过滤和快速蛋白液相色谱(FPLC)分离纯化，得到天麻多肽，此肽具有良好的亲水性。3.4利用蛋白质对配体的特异亲和力而进行分离纯化利用生物大分子与某些相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的色谱方法，即亲和层析法。只需要一步处理即可使某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持较高的活性。目前亲和层析技术被广泛地应用在蛋白质研究和制备领域，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。利用该法从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高浓度活性物质 【】。Reddy等【】应用Cibacron Blue亲和层析的方法从心肌网状组织中提取了Ca2+-腺苷三磷酸酶。范继业等【】利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71428BAEEmg-1，纯化回收率达到62.5%。该方法成本较低，吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广，产品质量稳定。3.5根据选择性吸附性不同而进行分离纯化3.5.1 羟磷灰石层析吸附剂羟磷灰石可用于分离蛋白质和核酸。蛋白质中带负电基团与羟磷灰石晶体表面的钙离子结合，而带正电基团与磷酸基相互作用，羟磷灰石对蛋白质的吸附容量比较大。因此，根据蛋白质分子与吸附剂羟磷灰石之问的吸附能力和解吸性质的不同而达到分离的目的。3.5.2 疏水作用层析根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。其中，连接在支持介质上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。但是疏水层析的某些洗脱条件可能导致蛋白质的变性，而且还存在不可预测性，对某些蛋白质分离效果很好，对另一些则不好。因此，近年来发展的新方法，常用硫酸铵沉淀、离子交换和亲和层析之后，进行疏水层析的样品不需要透析、凝胶过滤等方式脱盐。3.6 色谱法3.6.1反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法通常采用低离子强度酸性有机冲洗液和烷基硅胶键合固定相，影响分离的因素主要有流动相组成、洗脱湿度、洗脱液pH值、离子对试剂和流速等；有利于分离的条件是低pH值、流动相、室温或较高的温度及使用乙腈或异丙醇作为有机部分，三氟乙酸(TFA)对于蛋白质及气相色谱公认是一种较好的流动相添加剂。蛋白质的保留性质和选择性还与键合固定相的性质有关，采用大孔硅胶和短链烷基键合固定相在蛋白质分离中具有优势。3.6.2正交轴逆流色谱法正交轴逆流色谱法是新近发展起来的一种方法。具体是：以m(质量分数为12.5%的PEG8000)：m(质量分数为25%的磷酸氢二钾)=1：1或m(质量分数为12.5%的PEG8000)：m(质量分数为30%磷酸氢二钾)=1：1为溶剂系统，以下相作流动相，上相作固定相，操作时采用500r/min的转速和600ml/h的流动相流速。该方法在分离度不大的基础上提高了进样量，适用于分离天然生物大分子。3.6.3 微乳液毛细管电动色谱分离法(MEEKC)微乳液毛细管电动色谱分离法是在胶束电动色谱(MEKc)基础上发展起来的，在MEKC中，分离载体为离子胶束，它由表面活性剂组成，不同的表面活性剂构成不同的胶束，因而具有不同选择性，若以水包油微乳液作为分离载体，则称之为MEEKC法，该法是一种新型的分离技术，目前多用于小分子中性物质的分离。3.7蛋白质分离纯化新技术简介3.7.1微流控芯片技术微流控芯片技术是采用微加工技术在芯片表面形成微流路，将样品的采集、加工、检测等功能单元集成在数平方厘米的支持物表面，以色谱泵或电场为驱动力，连续完成多步反应或分离的一种技术。具有分析速度快、可集成化、自动化以及便于携带等特点。微流控芯片毛细管电泳技术在蛋白质的分离分析方面有较广泛的应用，该技术将常规的毛细管电泳操作在芯片上进行，利用玻璃、石英或各种聚合物材料加工微米级通道，以高压直流电场为驱动力，对样品进行进样、分离及检测。芯片毛细管电泳系统具备分离时间短、分离效率高、系统体积小且易实现不同操作单元的集成等优点。3.7.2联用技术液相色谱/质谱联用技术是近年来研究的热点。随着电喷雾(ESI)接口技术的发展，HPLC-ESI-MS联用技术为蛋白质的检测提供了强有力的工具。这种技术耗样量少、精确度高、快速方便，可以用于不纯或者复杂混合物的分析。与传统HPLC技术相比，Nano-LC有更高的分离效率，更高的灵敏度，同时减少了流动相的用量和损耗，但是由于其只有很小的柱容积，使得其进样量很小，因此不能达到很高的灵敏度。当电喷雾(ESI)接口技术作为恒流离子技术用于Nano-LC-MS联用，流速的降低可以增加气态相中离子的数目，从而增加了分离系统的灵敏度。Nano-LC-MS联用技术在分离蛋白质、多肽等大分子领域已经有较为广泛的应用。CE-MS联用技术在生命科学领域的应用尚处于起步阶段，但因为其可以使复杂混合物中的被分离成分根据其分子结构而被表征，对其他选择性较差的检测系统起到了较强的补充作用。LC-NMR-MS联用系统在单独的LC分离后，同时获得MS和NMR数据。MS对化合物进行快速扫描，提供初步的结构信息：NMR作为辅助，进行详细的结构解析，提供了一种实时复合矩阵分析的模式。HPLC-CE联用技术特别适合细胞或组织中蛋白质的分离，可很好地分离利用HPLC无法分离的蛋白质。4 展望在实际工作中，很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化，往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。理想的蛋白质分离提纯方法，要求产品纯度和总回收率越高越好，但实际上两者难以兼顾，因此，考虑分离提纯的条件和方法时，不得不在两者之间作适当的选择；一般情况下，科研上更多地选择前者，工业生产上更多地选择后者。因此，每当需要提纯某种蛋白质时，首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质，以便选择最佳的分离纯化方法，从而得到理想的效果。今后，蛋白质提纯技术的发展将不断促进对蛋白质性质的研究，同时对蛋白质性质的研究也将反过来提高蛋白质分离纯化技术，两者的互相促进终将会对生命科学的进步作出重大贡献。参考文献1 鲁碧楠，等蛋白质分离分析中的色谱技术新进展J.中国现代应用药学杂志2009(13): 1116 l1222 张养军，等分离分析技术在蛋白质组学研究中应用的新进展J.色谱 2009(05)3 王子佳，等。蛋白质分离纯化方法研究进展J.化学与生物工程.2009（8）：811.4 阚建全主编.食品化学M.北京：中国农业大学出版社，2002(9).5 张玉香，尹卓荣甘露糖蛋白的提纯及分子量测定J酿酒科技，2005，(4)：72746 王章存，聂卉，康延玲酶法提取大米蛋白研究进展J现代食品科技，2006，22(3)：2552587 陶兴无，高冰大米渣蛋白提纯及增溶工艺研究J中国酿造，2007，(8)：14168 李喜红，代红霜，魏安池酶法从脱脂米糠中提取蛋白质J粮油加工与食品机械，2005，(6)：62649 胡耀星，周念波，赵为鱼鳞中胶原蛋白的提取纯化及应用J武汉生物工程学院学报，2006，2(2)：115一l1710 顾有方，刘艳慧，陈会良，等免疫球蛋白分离提取方法及其应用的研究进展J畜牧兽医科技信息，2004，(12)：12-1411 王洪新，胡昌云茶叶蛋白质提取及初步纯化研究J食品工业科技，2004，25(12)：697112 李殿宝从葵花脱脂粕中提取分离蛋白质工艺的研究J辽宁师专学报(自然科学舨)，2005，7(1)：10410813 李凤英，崔蕊静，李春华葡萄籽蛋白质的提取工艺研究J中国油脂，2005，30(4)：505314 郭荣荣，潘思轶，王可兴碱法与酶法提取大米蛋白工艺及功能特性比较研究J食品科学，2005，26(3)：173一I7715 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