利用组学技术检测转基因作物的非期望效应.pdf

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2005 13 6 802 807 基金项目 十五 国家高技术研究与发展计划 863 项目 No 2004AA212221 资助 共同第一作者 李欣 女 1981 年生 博士研究生 黄昆仑 男 1968 年生 博士 副教授 通讯作者 Author for correspondence Tel 62736479 O E mail 收稿日期 2004 12 28接受日期 2005 10 10 综述 利用 组学 技术检测转基因作物非期望效应的潜在性 李欣 黄昆仑 朱本忠唐茂芝罗云波 中国农业大学食品科学与营养工程学院食品生物技术实验室 北京 100083 摘要 检测由遗传修饰引起的非期望效应是进行转基因作物安全性评价的一项重要内容 以 实质等同性 概念为基础的 评价方法 重点对转基因作物和非转基因亲本中的关键性成分进行定性 定量分析和比较难以充分考虑到一些不可预见因素 的发生 组学 技术通过对转基因作物的整个功能基因组 蛋白质组以及代谢组进行分析 将结果与非转基因亲本进行比较 完善了目前所广泛采用的以 实质等同性 概念为基础的定向方法 组学 技术是很有潜力的 综述介绍了功能基因组学 蛋 白质组学和代谢组学所用技术的原理和方法 重点讨论了这三大 组学 技术在评价转基因作物非期望效应中的应用和局限 性 介绍了转基因食品食用安全性评价中非期望效应检测方面的最新进展 关键词 安全评价 实质等同性 功能基因组学 蛋白质组学 代谢组学 Potentiality of Omics Techniques for the Detection of Unintended Effects in Genetically Modified Crops LI Xin HUANG Kun Lun ZHU Ben ZhongTANG Mao ZhiLUO Yun Bo The detection of unintended effects is a crucial step in the safety evaluation of genetically modified GM crops Target ed approach based on the principle of Substantial Equivalence focusing on the qualitative and quantitative analysis of key elements between GM crop and its counterpart hardly cover the occurrence of unpredictable changes The functional genomics proteomics and metabolomics are evolved to detect unintended effects which might in future complement present widely be used as targeted ap proach The three omics techniques are potentially powerful but much work has still to be done In this review the techniques are described together with their current applications and limitations introducing recent study progresses in the aspect of the detection of unintended effects in food safety evaluation of GM crops safety assessment substantial equivalence functional genomics proteomics metabolomics 自从 1983 年世界首例转基因烟草问世以来 转 基因作物的研究 开发和商业化速度发展很快 但由 于其用于生产和消费的时间短 转基因作物的安全 性和可靠性受到人们的广泛关注 关注的焦点之一 是转基因作物的非期望效应 非期望效应指的是 在考虑了目的基因插入产 生的可预料效应的情况下 转基因与非转基因亲本 在相同环境和条件下种植 在表型 反应和组成上 所显示出的统计学显著的差异 Cellini 2004 如新成分的产生或原特性的丧失等 或者是由于基 因插入后对代谢过程酶的调节对作物表型产生的影 响 表 1 列举了一些转基因作物在表型和组分上发 生的非期望效应 在转基因食品安全性评价中特别 值得注意的是一些有害成分的变化 如豆科植物中 的凝血素类和胰蛋白酶抑制剂类 马铃薯 番茄中的 酚类和生物碱类 叶类蔬菜中的亚硝酸盐类等抗营 养因子和生物毒素 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 第 6 期李欣等 利用 组学 技术检测转基因作物非期望效应的潜在性 寄主植物特性非期望效应 Host plantTraitUnintended effect 马铃薯 Potato 小麦 Wheat 大豆 Soybean 小麦 Wheat 水稻 Rice 马铃薯 Potato 马铃薯 Potato 油菜 Canola 水稻 Rice 表达蔗糖 6 果糖基转移酶 Expression of bacterial levansucrase 表达磷脂酰丝氨酸合成酶 Expression of phosphatidyl serine synthase 表达草苷膦 EPSPS 抗性 Expression of glyphosate EPSPS resistance 表达葡萄糖氧化酶 Expression of glucose oxidase 表达大豆球蛋白 Expression of soybean glycinin 表达大豆球蛋白 Expression of soybean glycinin 表达酵母转化酶 Expression of yeast invertase 超量表达八氢番茄红素合成酶 Overexpression of phytoene synthase 表达类胡罗卜素生物合成途径 Expression of carotenoid biosynthetic pathway 块茎组织代谢紊乱 韧皮部碳水化合物转运受损 Adverse tuber tissue perturbations and impaired carbohydrate transport in the phloem Turk and Smeekens 1999 Dueck 1998 坏腐 Necrotic lesions Delhaize 1999 高土温下 45 茎秆开裂 产量下降 40 以上 正常土温下 20 木质素含量高达 20 Splitting stems and yield reduction up to 40 at high soil temperatures 45 and higher lignin content 20 at normal soil temperatures 20 Gertz 1999 产生植物毒素 Phytotoxicity Murray 1999 维生素 B6 增加 50 Increased Vit B6 content 50 Momma 1999 龙葵碱含量增加 16 88 Increased glycoalkaloid content 16 88 Hashimoto 1999 a b 龙葵碱含量降低 37 48 Reduced glycoalkaloid content 37 48 Engel 1998 维生素 E 叶绿素 脂肪酸和八氢番茄红素的代谢发生变化 Multiple metabolic changes tocopherol chlorophyll fattyacids and phytoene Shewmaker 1999 形成其它类胡萝卜素衍生物 茁 胡萝卜素 叶黄素 玉米黄质 Formation of unexpected carotenoid derivatives beta carotene lutein and zeaxanthin Yel 2000 以 实质等同性 概念为基础的安全评价方法 只对所关注的某几种或几类物质进行研究 这种定 向比较转基因和非转基因作物成分的方法所得到的 结果是有偏倚的 Millstone 1999 不能充分考 虑由遗传修饰所引起的非期望效应 unintended ef fects 的发生 组学 方法用微阵列分析基因表达 蛋白双向电泳和质谱分析蛋白质 液谱结合核磁共 振分析化合物 从功能基因组 蛋白组 代谢组三个 水平检测转基因作物非期望效应 这套方法可以以 非选择性 无偏倚的方式筛选出被修饰寄主生物在 细胞或组织水平的生理或代谢水平的潜在变化 因 此能够成为食品安全评价的补充方案完善定向方法 Kuiper 2000 Kuiper 2001 Cellini 2004 综述从功能基因组 蛋白组 代谢组三个水平 介绍 组学 技术检测转基因作物非期望效应的研 究进展 1功能基因组学 Functional genomics 功能基因组研究的是被转录基因和相关调控元 件的功能 研究的方法包括差异显示反转录 PCR 基因表达序列分析 SAGE DNA 微阵列 遗传足 迹法 反向遗传学 蛋白质组 生物信息学等 由于利 用 DNA 测序或 PCR 差异显示等方法研究基因差 异表达都较为费力且不灵敏 DNA 微阵列却具有高 通量 高灵敏度 高效率的优点 因此成为全面而不 孤立地评价全部基因组的表达情况的理想选择 1 1DNA 微阵列技术 DNA microarray DNA 微阵列技术是一种高密度反向斑点杂交 技术 过程包括芯片制备 待检样品制备 探针杂交 检测以及数据处理 其优势在于灵敏度极高 mRNA 丰度低至 10 万分之一仍能被检测出 在一个固体表 面可排列多个探针 实现在同一反应中被检的标记 样品同时与多个探针杂交 大量地平行筛选不同来 源组织的基因表达差异 van Hal 2000 将用 微阵列技术建立的转基因植物单独的或混合组织样 品的基因表达图谱 与对照 未修饰的或整合有空载 体序列的 植物的同等类型的样品作比较 如果基因 表达图谱中检测到了表达差异 则可能发生了遗传 表 1 转基因作物表型和某组分发生的非期望效应 Table 1 Demonstration of unintended effects by phenotype selection or investigation of defined constituents 803 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 农 业 生 物 技 术 学 报2005 年 修饰的非期望效应 得到的结果可以进一步研究与 毒理学的关系 微阵列上可以使用 cDNA 或功能特性了解得 比较清楚的序列做探针 另外 可以使用与特定生 理 发育和环境条件所联系的表达序列标签 ESTs expressed sequence tags 做探针 研究与这些条件相 联系的代谢途径的变化 在检测转基因作物的非期 望效应方面 基因表达研究应该集中在抗营养因子 天然毒素和正向营养因子 微量和大量营养素 形成 的代谢途径上 在过去的几年中也开发了其它一些阵列 如电 荷阵列系统 electroarray system 和悬浮液阵列 suspension array 电荷阵列系统是将标记好的带负 电荷的 DNA 溶液与阵列上带正电的点杂交 http 悬浮液阵列的探针是结合在特定的 polystrene 的珠 子上 而不是常见的基因特异的 PCR 产物通过点样 或原位合成结合在固体支持物表面 Nolan and Sklar 2002 1 2DNA 微阵列技术在非期望效应检测中的应用 目前还没有用 DNA 微阵列技术检测转基因产 品非期望效应所发表的数据 欧盟第 5 框架项目 GMOCARE cts GMOCARE default htm 正在评估 DNA 微阵列 技术用于转基因食品安全评价分析基因表达差异的 可行性 DNA微阵列技术虽然有很多优势 但在用于评 价转基因作物基因表达水平的非期望效应之前 应 该注意 为了从芯片的杂交结果中得到更多的信 息 应该从所要研究作物的相关组织中选取尽量多 的序列点样 点样的序列最好是不冗余的 Franssen van 2002 阵列中最好包括通常 在组织中不表达 但是由于遗传修饰可能被激活的 代谢途径的序列 由于基因组数据库中关于 ESTs 的注释不是很可靠 在讨论所检测到的差异与毒理 学关系之前要确认 ESTs 的功能 Sommerville 2002 严格取样过程 因为用于点样的来自不同 组织样品中 RNA 的变异本身 可能要比由于遗传 修饰造成的基因表达差异更大 对杂交结果进行 数据分析很关键 目前这类软件的发展很快 已经有 将序列信息 遗传信息 表型信息 基因表达 调控和 功能相结合的数据库出现 Lockhart and Winzeler 2000 Gerstein 2000 Bassett 1999 2蛋白质组学 Proteomics 蛋白质组学是以蛋白组为研究对象的研究领 域 蛋白质组是在一种细胞内存在的全部蛋白质 Humphery 1997 蛋白质组学实质上是三大 技术的融合 即高分辨双向电泳 2 DE 分离组织中 的蛋白 图像分析比较分离结果 质谱 MS 分析感 兴趣蛋白的性质 蛋白组学主要应用于 3 个领域 确定蛋白 前体以及翻译后修饰 用差异显示蛋 白质组以确定蛋白质量上的变异 研究蛋白质与 蛋白质的交互作用 2 1蛋白质组学在检测非期望效应中的应用 蛋白质组学方法完善了其它 组学 方法 对理 解发育 结构和代谢很关键 随着数据库的扩大和完 善 从双向蛋白电泳凝胶上确定蛋白的能力会不断 增强 蛋白质组学技术将成为检测转基因作物非期 望效应的很有前途的方法 除此之外 蛋白质组学方 法能用于确定前体 翻译后修饰和蛋白质的降解产 物 蛋白质组学方法结合人血清免疫印迹方法能够 确定作物或食物成分 如乳化剂和泡沫稳定剂 中 的潜在过敏原 结合免疫学检测方法可以确定新的 融合蛋白是不是产生于转基因整合位点 用 反 义 技 术 开 发 的 低 谷 蛋 白 稻 米 用 SDS PAGE 发现其它蛋白如醇溶谷蛋白的水平非期 望性地增长 ftp ftp fao org es esn food Bio 12 pdf 用标准的营养分析 总蛋白 氨基酸图谱 这是检 测不到的 但是这种低谷蛋白稻米如果用作食品 会 影响营养品质甚至产生过敏 这个例子用的虽然不 是蛋白质组学的方法 但很近似 目前蛋白质组学的 方法还未曾使用 但是可以看出蛋白质组学将是检 测和分析转基因作物或其它育种方法培育的作物非 期望效应的很有用的工具 2 2蛋白质组学技术用于非期望效应检测的限制 因素 在蛋白质组学的研究中 从蛋白质的提取 样品 处理到电泳 染色各个过程都会直接影响检测结果 的真实有效性 目前 双向电泳凝胶检测的蛋白质数 目比估计的细胞内总蛋白少得多 2 2 1提取过程蛋白质提取的难易主要看蛋白 质的来源 植物 组织 细胞分隔 蛋白结构 疏水 蛋白 如膜蛋白 和过大 过小的蛋白质 极端酸性 碱性的蛋白质在提取过程中很容易丢失 低拷贝 数的蛋白质可能检测不到 用图像模型分析 2 D 电 泳所能分辨的蛋白拷贝数 结果表明当蛋白质的拷 804 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 第 6 期李欣等 利用 组学 技术检测转基因作物非期望效应的潜在性 贝数低于 1000 时 2 D 电泳技术是不能分辨出来的 Goffeau and Barrell 1996 2 2 2样品处理过程一是背景噪音问题 蛋白在 提取和消化过程中的丢失 凝胶的污染 去污剂与质 谱分析仪的作用等 都增加了化学分析的背景噪音 为了分析低拷贝蛋白质 必须减少蛋白质的损失 简 化样品处理步骤 应用超声组织粉碎仪 超速离心机 等措施 提高提取和消化蛋白质的量 降低化学噪音 Blomberg 1995 因此 要真正解决低拷贝数 蛋白的检测和鉴定尚需要技术的突破 二是可重复 性问题 虽然一些对照样品在同一块凝胶上跑电泳 样品处理和电泳过程仍存在可重复性的问题 2 2 3染色过程染色过程的灵敏度限制了用于 上样 定性和定量的蛋白质的量 因为双向电泳凝胶 图样的统计处理还没有完全解决 2 2 4为了使不同实验室得到的数据组之间能作 比较 需要发展出一套样品分离和电泳的标准方法 因为在这个多步骤的过程中 很小的变化就能对最 终得到的蛋白图样有很大的影响 此外也需要了解 有关天然变异的背景信息 2 2 5不同种类作物的发育过程 贮藏情况 遗传 农艺和环境因子同样会影响蛋白组 还有一个值得 考虑的问题是 样品可能含有非宿主蛋白 例如由于 有植物内生的微生物 真菌 细菌和病毒 感染的 植物材料和健康的蛋白图样不同 3代谢组学 Metabolomics 3 1代谢组与代谢组学 细胞中代谢物的总和叫做代谢组 代谢组学研 究的是生命个体对环境刺激或遗传修饰所做出的所 有代谢应答的量度 根据研究对象和目的的不同 Fiehn 2000 把有关代谢方面的研究分为 4 类 从中可以更好地 理解代谢组学所处的地位和作用 靶标化合物分 析 target compound analysis 分析受修饰或实验直 接影响的某个或某几个化合物 代谢物分析 metabolic analysis 分析与已知代谢相连的一组化 合物 图谱分析 fingerprinting 不做单个化合物 的定性和定量分析 而是广泛分析大量数据 做样品 的快速分类 代谢组学 辐射全部的化合物类别 力求分析生物体系 如体液和细胞 中的所有代谢产 物 为尽量多的各个化合物定性和定量 整个分析过 程应能尽可能地保留和反映总的代谢产物信息 与转录组学和蛋白组学比较 代谢组学有以下 优点 Taylor 2002 基因和蛋白表达的微小 变化会在代谢物上得到放大 从而使检测更容易 代谢组学的研究不需建立全基因组测序及大量 EST 的数据库 代谢物的种类要远小于基因和蛋 白的数目 每个组织中大约为 103 数量级 即使在最 小的细菌基因组中也有几千个基因 研究中采 用的技术更通用 这是因为给定的代谢物在每个组 织中都是一样的缘故 完整的代谢组学分析的流程包括样品的采集和 预处理 数据的采集和数据的分析及解释 目前代谢 组学用到的主要技术是气相色谱 GC 高效液相色 谱 HPLC 和核磁共振 NMR 分析上述类型的 1 和 2 常用色谱法分离 用色谱法时要针对具体的分析 物做校准 核磁共振和傅立叶转化近红外谱 FTIR 质谱 MS 用于粗提物的指纹图谱分析 代谢组学结 合了类型 1 2 和 3 的元素 确保能做出足够精确的 有效定量比较 当然提取和测量步骤不是对每一个 要测量的单一化合物都最适合的 3 2代谢组学技术在转基因作物非期望效应检测 中的应用 色谱技术因其卓越的分离性能 高灵敏度已被 广泛用于复杂体系 如体液 中的靶标分析 如标记 物分析 质谱由于其普适性 高灵敏度和特异性 被 广泛地应用于代谢组学研究领域 目前 GC MS 是 最广泛使用的方法 一是因为 GC MS 可以对未知 结构的代谢物定量 另一个是可以用特征离子对有 相似保留时间 不同特征离子 的不同组分进行定 量 Roesnner 2000 利用 GS MS 分析技术 对 马铃薯块茎中 150 种化合物进行了定性和定量分 析 确定了过度表达葡萄糖激酶基因 葡萄糖磷酸酶 基因等转化了不同基因的转基因植株的生物化学表 现 是一个用代谢组学技术比较转基因植株和非转 基因亲本在代谢产物方面的差别的例子 NMR 也是当前代谢组学研究中的主要技术 它 的优势在于能够对样品实现非破坏性 非选择性的 分析 H 1 NMR 对含氢化合物均有响应 能完成代 谢产物中大多数化合物的检测 满足了代谢组学中 的对尽可能多的化合物进行检测的目标 Le Gall 2003 利用 H 1 NMR 分析技术 对同时转有玉米 转录因子 LC 和 C1 过度表达黄酮醇的转基因番茄 及其非转基因亲本在不同成熟度进行代谢物轮廓谱 分析 通过比较发现在红熟时期转基因番茄除了 6 种主要类黄酮苷的含量比非转基因番茄显著增加 外 柠檬酸 果糖 苯丙氨酸等至少 15 种代谢物在含 805 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 农 业 生 物 技 术 学 报2005 年 量上是有显著差异的 但这种差异不到三倍 处于田 间种植作物的天然差异范围 这项研究说明了化学 计量学方法结合 NMR 是可以检测即使是较为微弱 的转基因作物的非期望效应的 4展望 组学 技术大大增加所分析化合物的数量 由 此降低不确定性 是非定向 无偏倚的检测非期望效 应的有效方法 是转基因食品安全评价进一步完善 的发展方向 然而 在真正发挥效力之前还有很多工 作要做 比如在取样和提取步骤上 方法的标准化 上 掌握作物种属间关于自然变异的背景信息上 此 外 一个严重的障碍是破解出所观察到的潜在差异 与生物学和毒理学效应的关系 为此 拥有包括了不 同发育阶段 不同生长环境下特定作物品种的有关 基因转录 蛋白质和代谢产物轮廓谱数据的交互式 数据库是很有帮助的 目前世界各国正着力开发的第二代转基因作物 加强了营养方面的特性 由遗传修饰带来的对代谢 过程的影响将更为复杂 引入植物中的新的生物合 成途径或是针对一级和二级代谢关键酶的遗传修 饰 可能会产生代谢干扰 这是用我们对植物学以及 代谢途径的整合和交互联络的现有知识所不能解释 的 由此可能导致不可预计的非期望效应以及定向 方法所不能显示的代谢物水平的变化 因此 如果将 来能成功解释 组学 技术得到的结果的话 这可 能对下一代转基因作物的安全性评价更有意义 参 考 文 献 Bassett D E Eisen M B and Boguski M S Gene expression in formatics it s all in your mine 1999 21 Suppl 51 55 Blomberg A Blomberg L Norbeck J Fey S J Larsen P M Larsen M Roepstorff P Degand H Boutry M Posch A and G rg A Interlaboratory reproducibility of yeast protein pat terns analyzed by immobilized pH gradient two dimensional gel electrophoresis 1995 16 1935 1945 Cellini F Chesson A Colquhoun I Constable A Davies H V Engel K H Gatehouse A M R K renlampi S Kok E J Le guay J J Lehesranta S Noteborn H P J M Pedersen J and Smith M Unintended effects and their detection in genetical ly modified crops 2004 42 1089 1125 Delhaize E Hebb D M Richards K D Lin J M Ryan P R and Gardner R C Cloning and expression of a wheat phosphatidylserine synthase cDNA Overexpres sion in plants alters the composition of phospholipids 1999 274 7082 7088 Dueck Th A van der Werf A Lotz L A P and Jordi W Method ological Approach to a Risk Analysis for Polygene Genetical ly Modified Plants GMPs A Mechanistic Study Wagenin gen Research Institute for Agrobiology and Soil Fertility AB DLO 1998 Engel K H Gerstner G and Ross A Investigation of glycoalka loids in potatoes as example for the principle of substantial e quivalence Novel Food Regulation in the EU Integrity of the Process of Safety Evaluation Berlin Federal Institute of Con sumer Health Protection and Veterinary Medicine 1998 197 209 Fiehn O Kopka J D rmann P Altmann T Trethewey R N and Willmitzer L Metabolite profiling for plant functional ge nomics 2000 18 1157 1161 Franssen van Hal N L W Vorst O Kramer E Hall R D and Kei jer J Factors influencing cDNA microarray hybridization on silylated glass slides 2002 308 5 17 Gerstein M Integrative database analysis in structural genomics 2000 7 Suppl 960 963 Gertz J M Vencill W K and Hill N S Tolerance of transgenic soybean to heat stress 1999 Brighton Crop Protection Conference Weeds Proceedings of an Internation al Conference Brighton British Crop Protection Council Farnham 1999 835 840 Goffeau A and Barrell B G Life with 6000 genes 1996 274 546 Hashimoto W Momma K Katsube T Ohkawa Y Ishige T Kito M Utsumi S and Murata K Safety assessment of genetically engineered potatoes with designed soybean glycinin Compo sitional analyses of the potato tubers and digestibility of the newly expressed protein in transgenic potatoes 1999a 79 1607 1612 Hashimoto W Momma K Yoon H J Ozawa S Ohkawa Y Ishige T Kito M Utsumi S and Murata K Safety assessment of transgenic potatoes with soybean glycinin by feeding stud ies in rats 1999b 63 1942 1946 Humphery S L Cordwell S J and Blackstock W P Proteme re 806 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 第 6 期李欣等 利用 组学 技术检测转基因作物非期望效应的潜在性 search Complementarity and limitation with respect to the RNA and DNA world 1997 18 1217 Kuiper H A Dealing with unintended effects Evaluating Sub stantialEquivalence ASteptowardsImprovingthe Risk Safety Evaluation of Genetically Modified Organisms Vienna Federal Environment Agency 2000 69 72 Kuiper H A Kleter G A Noteborn H P J M and Kok E J As sessment of the food safety issues related to genetically modi fied foods 2001 27 503 528 Le Gall G Colquhoun I J Davis A L Collins G J and Ver hoeyen M E Metabolite profiling of tomato using H 1 NMR spectroscopy as a tool to detect potential unintended effects following a genetic modification 2003 51 2447 2456 Lockhart D J and Winzeler E A Genomics gene expression and DNA arrays 2000 405 827 836 Millstone E Brunner E and Mayer S Beyond substantial equiv alence 1999 401 525 526 Momma K Hashimoto W Ozawa S Kawai S Katsube T Takaiwa F Kito M Utsumi S and Murata K Quality and safety evaluation of genetically engineered rice with soybean glycinin Analyses of the grain composition and digestibility of glycinin in transgenic rice 1999 63 314