北方地区大豆根瘤菌的生物学特性.pdf

第 38卷第 1期 2007年 2月 土 壤 通 报 Chinese Journal ofSoil Science V o l 38 No 1 Feb 2007 北方地区大豆根瘤菌的生物学特性 刘灵芝 陈玉玲 陈志刚 姜 亮 吕晓锋 沈阳农业大学 土地与环境学院 沈阳 110161 摘 要 对北方地区大豆根瘤菌的生物学特性进行了较为系统的研究 结果表明 黑 辽地区分离 纯化的 17株根瘤菌 均具有典型的根瘤菌的个体形态和菌落特征 生理生化指标接近 可与辽豆 15共生结瘤 分为快生菌和慢生菌 所有根瘤 菌均可不同程度地利用供试的 5种碳源 耐酸碱度 耐盐性及温度敏感实验表明 菌株 HS3可在 pH6 0 9 0生长 菌株 HH4可耐受 1 5 氯化钠 菌株 HH4 HH2可在 13 39 生长 关 键 词 大豆 根瘤菌 生物学特性 中图分类号 Q939 11 4 文献标识码 A 文章编号 0564 3945 2007 01 0141 04 北方是我国大豆主产区 根瘤菌作为一类重要的 土壤微生物类群 在大豆的氮素营养等方面起着不可 替代的作用 自 1896年诺贝 Nobbe 证明用根瘤菌 纯培养接种使豆科植物增产以来 根瘤菌在农业生产 中的应用逐渐受到重视 随着无公害农业的发展 接 种高效大豆根瘤菌 将产生更显著的社会与环境效 益 1 为使豆科作物高产 就必须选育出与豆科植物相 匹配的大豆根瘤菌 因此 豆科植物与大豆根瘤菌的共 生特性 大豆根瘤菌的生物学特性的研究在菌剂应用 中具有实际意义 本研究在北方不同地区 从大豆种植区分别采集 和分离到多株大豆根瘤菌菌株 并依据其生长特性 筛 选出有代表性 17株菌株 在相同条件下研究其生物学 特性 以期为北方地区大豆根瘤菌的生产应用研究提 供参考依据 1 材料与方法 1 1 供试菌株 大豆根瘤菌菌株 LK3 LK4 LK5分离于辽宁开 原 菌株 LB2 LB3 LB4 LB5分离于辽宁本溪 菌株 HL3 HL4 HL5分离于黑龙江林口 菌株 HH 2 HH4 HH5分离于黑龙江海伦 菌株 HS1 HS2 HS3分离于 黑龙江双城 1 2 结瘤实验 2 将大豆种子于 95 乙醇浸泡 30s 回收乙醇 用 0 1 氯化汞浸泡 5m in 回收氯化汞 无菌水冲洗三次 后 置于无菌培养皿中 28 催芽 待根长至 1c m 时 以 无菌蛭石为基质 采用砂培法种植大豆 根瘤菌制成 菌悬液 接种于已经种上豆种的蛭石表面 每菌株 3次 重复 设不接种的大豆为对照 60天后收集根瘤 测 定根瘤总数 根瘤干重 植株干重及植株全氮量 1 3 代时测定 接种根瘤菌于 YMA培养液中 28 摇床培养 8h 后用 721型分光光度计测定光密度值 持续测 36 42h 以培养时间为横坐标 光密度值为纵坐标绘制生 长曲线图 以光密度值倍增时间为菌株世代时间 1 4 生理生化实验 3 酮基乳糖 淀粉水解 柠檬酸盐利用实验 牛肉 膏蛋白胨实验 明胶水解 石蕊牛奶反应等按常规方法 进行 3 以上实验均设空白对照 3次重复 无菌操 作 1 5 碳源利用 以去掉甘露醇的 YMA 培养基为基本培养基 采 用生长谱法 4 测定各菌株碳源利用情况 1 6 耐盐实验 改变 YMA液体培养基中氯化钠含量 分别调至 0 0 01 0 2 0 5 1 0 1 5 2 0 灭菌后 分装各试管 5m l 以不接菌为对照 28 摇床培养 3 7天观察结果 1 7 耐酸碱度 采用 YMA液体培养基 灭菌后调节 p H 值分别为 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 10 0 培养 7天后观察结 果 1 8 温度敏感实验 采用 YMA 液体培养基 接种后 分别置于 4 13 22 30 39 46 培养 7天后观察结果 2 1 共生特性 收稿日期 2006 01 05 修订日期 2006 03 09 基金项目 沈阳农业大学青年基金项目资助 200409 作者简介 刘灵芝 1974 女 黑龙江省佳木斯市人 硕士 讲师 主要从事微生物教学与科研 Te l 024 88849991 T ax 024 88487155 E mai l lzliu syau edu cn 2 结果与分析 将 17株根瘤菌接种到辽豆 15后 结果表明 供试 菌株均能与辽豆 15有效结瘤 菌株平均结瘤数为 47 说明土著根瘤菌具有较强的结瘤性 但从结瘤情况可 看出 不同菌株的共生特性存在着明显的差异 其中 结瘤数最多者 菌株 HS1 为最少者 菌株 LK5 的 6 1 倍 植株干重最高者 菌株 HH4 为最低者 菌株 LK5 的 2 09倍 根瘤干重最高者 菌株 LB2 为最低者 菌 株 LK5 的 13倍 植株全氮量最高者 LB4 为最低者 LK5 的 2 4倍 从实验结果可知 菌株结瘤数与根 瘤干重之间因根瘤大小不一 二者没有相关性 而多数 植株的干重与植株全氮量之间存在着一定的相关性 这与徐传瑞等 5 提到的固氮效率高的菌株可以为植 株提供更多的氮素 因此植株生长更为旺盛 干重也更 高的观点相符合 实验中部分植株虽干重较大 但叶 色发黄 其植株全氮量并不高 因此 植株干重与全氮 量之间的关系还需进一步考察 2 2 生长特性 分离纯化的根瘤菌在 YMA平板上生长 细胞杆 状 菌落圆形 隆起 乳白色或半透明 边缘整齐 具光 泽 在分离培养过程中 发现各菌株之间的生长速度 存在很大的差异 部分菌株在 2天内能形成良好的典 型菌落 而一些菌株则需要 6 7d或更长时间才能形 成 按其生长速度可将根瘤菌分为快生菌与慢生 菌 6 快生根瘤菌平均代时为 2 4h 从根瘤分离时 3 4d可在平板看到单个菌落 慢生根瘤菌平均代时 7 9h 从根瘤分离时 7 10d才能在平板上看到单个 菌落 结合生长代时测定 所分离 17株根瘤菌中 9 株为慢生菌 8株为快生菌 各菌株生长特性见表 1 表 1 根瘤菌的生长特性 T able 1 Growth characteristics of rhizobia 菌株名称 Strain name 代时 h Generation ti m e 菌落形成 d Formation ti me of colony 菌株名称 S train name 代时 h Generation ti me 菌落形成 d Formation ti m e of colony LK33 63 4HL59 39 10 LK413 59 10HH 18 26 7 LK57 96 7HH 24 13 4 LB24 23 4HH 43 12 3 LB310 09 10HH 52 72 3 LB46 956 7HS38 09 10 LB54 03 4HS22 42 3 HL36 15 6HS14 53 4 HL48 06 7 2 3 生理生化特性 各菌株的生理生化特性见表 2 所有供试菌株均 表现为 3 酮基乳糖 淀粉水解 明胶水解 甲基红试 验 V P反应阴性 表明菌株不具备利用相关物质的 酶 部分菌株表现为柠檬酸盐利用 牛肉膏蛋白胨阳 性反应 表明该菌株具有利用相关物质的能力 石蕊 牛奶反应中 8株快生菌中除 LB2 LB5产碱外 其余菌 株均产酸 9株慢生菌中除 LK5产酸外 其余均产碱 表 2 根瘤菌部分生理生化特性 T able 2 Some physiological and biochemical properties of rhizobia 菌株名称 Strain na m e 3 酮基乳糖 3 ketolactose 淀粉水解 Starch hydrolysis 柠檬酸盐 利用 Citrate test 牛肉膏 蛋白胨 BP 石蕊 牛奶反应 L it m us m ilk test 甲基红 试验 MR test 明胶水解 Gelatin hydrolysis 乙酰甲基 甲醇试验 V P test LK3 产酸 LK4 产碱 LK5 产酸 LB2 产碱 LB3 产碱 LB4 产碱 LB5 产碱 HL3 产碱 HL4 产碱 HL5 产碱 HH 1 产碱 HH 2 产酸 HH 4 产酸 HH 5 产酸 H S3 产碱 H S2 产酸 H S1 产酸 2 4 碳源利用 靖元孝等 7 认为慢生型根瘤菌利用碳源范围较 窄 一般不能利用蔗糖 麦芽糖 乳糖等双糖 本研究 中 葡萄糖 果糖 麦芽糖 乳糖 蔗糖五种供试碳源均 可不同程度地被 17株大豆根瘤菌所利用 表 3 在 双糖利用中 快生菌与慢生菌并未表现出明显的区别 五种碳源中 所有菌株对果糖具有较好的利用能力 而 部分菌株如 LK3 LK5 LB3 HH2则表现为葡萄糖利用 能力较弱 2 5 耐盐性 土壤盐碱化是国内外普遍存在的问题 近年来利 用根瘤菌改善盐碱地的研究日趋活跃 因此 选育耐 盐性强的根瘤菌对改善盐碱地有着积极意义 实验表 明 所分离根瘤菌均可在无盐培养液中生长 而少量氯 化钠的添加则有助于根瘤菌的生长 供试菌株均可在 0 0 5 氯化钠中生长 当氯化钠浓度达到 1 时 绝 大多数根瘤菌生长受到抑制 氯化钠浓度达到 2 时 所有菌株均不生长 17株根瘤菌中 仅 HH4菌株可 在 1 5 氯化钠中生长 表现出一定程度的耐盐性 表 142土 壤 通 报 38卷 4 表 3 根瘤菌的碳源利用情况 T able 3 Carbon source utilization of indigenous rhizobia 菌株 Strain 碳源 Carbon source 葡萄糖 G lucose 果糖 Fructose 麦芽糖 M altose 乳糖 Lactose 蔗糖 Sucrose LK3 LK4 LK5 LB2 LB3 LB4 LB5 HL3 HL4 HL5 HH1 HH2 HH4 HH5 HS3 HS2 HS1 表 4 根瘤菌的耐盐性 T able 4N aC l tolerance of indigenous rhizobia 菌株 Strain NaCl 00 010 20 51 01 52 0 LK 3 LK 4 LK 5 LB2 LB3 LB4 LB5 HL3 HL4 HL5 HH1 HH2 HH4 HH5 HS3 HS2 HS1 注 生长良好 生长较好 生长一般 生长差 不 生长 2 6 耐酸碱性 土壤 p H 可影响根瘤菌的结瘤效应 偏酸与偏碱 的环境条件对根瘤菌的生长和结瘤均有明显的的抑制 作用 8 了解根瘤菌耐酸 耐碱能力对于其应用于不 同土壤条件中与大豆品种的共生结瘤具有一定的指导 价值 实验表明 表 5 供试菌株的最适生长 p H 范 围是 7 0 8 0 当 p H 9 0时 根瘤菌的 生长受到抑制 pH4 0或 pH10 0条件下 所有菌株均 不能生长 其中 LK5 HS3 HS2可在 p H9 0条件下生 长 表现出一定的耐碱性 此外 HS3亦可在 pH6 0 条件下生长 表现出较广的 p H 生长范围 2 7 温度敏感性 温度影响着根瘤菌的生长 北方总体气温较低 高 温在一定程度上会抑制根瘤菌的生长 耐高 低温菌株 的筛选有利于提高根瘤菌的生存与竞争能力 从表 6 中可看出 22 30 较适于根瘤菌的生长 当温度 大于 39 及小于 13 时 绝大多数供试根瘤菌生长受 到抑制 当温度小于 4 或大于 46 时 所有菌株均不 生长 其中菌株 HH2 HH4 HS1可在 13 生长 具有 一定的耐低温能力 菌株 HH4 HH2同时亦可耐受 39 高温 表现出较广泛的温度生长范围 表 5 pH对根瘤菌的影响 T able 5 Efiect of p H on indigenous rhizobia 菌株 Strain pH 4 05 06 07 08 09 010 0 LK3 LK4 LK5 LB2 LB3 LB4 LB5 HL3 HL4 HL5 HH1 HH2 HH4 HH5 HS3 HS2 HS2 表 6 温度对根瘤菌的影响 T able 6 Effect of temperature on indigenous rhizobia 菌株 Strain 温度 Temperature 41322303946 LK3 LK4 LK5 LB2 LB3 LB4 LB5 HL3 HL4 HL5 HH1 HH2 HH4 HH5 HS3 HS2 HS1 1431期 刘灵芝等 北方地区大豆根瘤菌的生物学特性 3 结论与讨论 3 1 供试菌株均具有典型的根瘤菌个体形态和菌落 特征 生理生化指标接近 接种辽豆 15均能结瘤 从 测定的各项结果表明 17株根瘤菌之间存在着差异 因此 可以认定所分离的 17个菌株为不同的大豆根瘤 菌菌株 3 2 接种根瘤菌在土壤中的生存定殖能力的强弱是 豆科植物接种成败的关键之一 针对不同土壤的理化 特性筛选出抗逆性强 适应力广的优良根瘤菌菌株做 为接种剂是目前研究的一个方向 本研究中 获得快 生菌 8株 慢生菌 9株 其中 菌株 HH4具有耐受 1 5 NaC l的能力 HS3可在 pH6 0 9 0中生长 具 有一定耐受酸 碱的特性 而菌株 HH2 HH4则可在 13 39 范围内生长 表现出较广的温度生长范围 对 于所分离的具有良好生物学特性的优良菌株 进一步 驯化与改良 对其今后的广泛应用将产生积极的意义 3 3 为提高根瘤菌菌剂结瘤 固氮效果 一定范围内 可通过增加菌体接种量来实现 然而由于单一菌株生 物学性质的限制 其在不同土壤的适应能力 竞争能力 都将影响其最终的定殖 结瘤情况 因此发挥多种根 瘤菌菌株的优势 9 体现综合效应 进行菌株的混合 接种 做为目前菌剂研究中的一具重要内容 在生产实 践中提高大豆根瘤菌结瘤与固氮作用更具实际意义 参考文献 1 李阜棣 胡正嘉 微生物肥料在持续发展农业中的应用 M 北 京 中国科技出版社 1994 2 李阜棣 喻子牛 何绍江主编 农业微生物学实验技术 M 北 京 中国农业出版社 1996 92 97 3 赵 斌 何绍江主编 微生物学实验 M 北京 科学出版社 2002 141 157 4 沈萍 范秀容 李广武主编 微生物学实验 M 北京 高等教育出 版社 1999 114 116 5 徐传瑞 章建国 周俊初 大豆根瘤菌的分离与筛选 J 华中农业 大学学报 2004 23 6 635 638 6 吕成群 黄宝灵 韦原莲等 相思树种根瘤菌的生物学特性 J 微 生物学通报 2003 30 4 1 5 7 靖元孝 陈北平 广东两种决明属 Cassia 植物根瘤菌的生物学 特性 J 热带亚热带植物学报 1996 4 2 47 52 8 杨江科 周 琴 周俊初 p H 对土壤中土著快 慢生大豆根瘤菌结 瘤的影响 J 应用生态学报 2001 8 12 639 640 9 FJ Temprano MA lbareda Surv ival of Several Rhizobium Bradyrhizobium Strains on D ifferent I noculation and Enocrlated Seed J Int M icrobia l 2002 5 81 86 Biological Characteristics of IndigenousRhizobia fro m Soybean in the North Area L I U L ing zh i CHEN Yu ling CHEN Zhi gang JI ANG L iang LU Xiao feng College of Land and EnvironmentalSciences Shenyang Agriculture University Shenyang 110161 China Abstract The biologic