灯盏乙素抗脑缺血机制 教育厅.doc

项 目 编 号云南省教育厅科学研究基金项目 申 请 书 自 然 科 学 基 础 应 用 研 究 基 金 项 目 人 文、社 会 科 学 研 究 基 金 项 目 2 类别: 科技开发，科技成果推广和科技兴农基金项 目 3 青 年 教 师 科 研 基 金 项 目 4 项 目 名 称：灯盏花乙素抗缺血性脑损伤作用的分子机 制研究 院 校：昆明医学院 系、 所、 室：云南省天然药物药理重点实验室 项目负责人姓名： 雷伟亚 电 话申 请 日 期：2004.3.1 云 南 省 教 育 厅 制填报说明 一、填写申请书前，请先查云南省教育厅科研经费管理办法及科学研究基金项目检查、评价实施办法。申请项目必须符合基金资助范围。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹清楚易辩。 二、申请书为十六开本，复印时用A4复印纸，于左侧装订成册。从第4页至12页各栏空格不够时，请自行加页。封面上“项目编号”申请者不必填写。 三、部分栏目填写要求： 类别在相应的基金类别后的“ ”中划“”。 项目名称应确切反映研究内容，最多不超过25个 汉字。 项目性质根据研究内容填写“基础研究”、“应用研究”、“开发研究”或“人文社科研究”。 所属学科及代码填写申请项目所属的最低层次学科及代码。（以中华人民共和国国家标准规定的学科分类与代码为准） 项目组主要成员指每年参加研究工作五个月以上，在项目组内起主要作用的人员，不包含申请者，最多录10名。 四、经费预算表（表二）中，其他经费来源一栏，指所申请的基金项目在其他渠道申请并获资助的请填明资助金额，申请过但未获准的项目请打“”，没有申请过的项目请填“” 。 五、项目申请书须经学校签署具体意见，加盖公章后一式三份报送云南省教委厅科技处。一、基 金 申 请 简 表 研 究 项 目项目名称灯盏花乙素抗缺血性脑损伤作用的分子机制研究项 目性 质应用研究所 属学 科名 称药理学代 码310.4710起止年月自2004年10月至2006年 10 月申请金额3.0万元 申 请 者 姓 名雷伟亚性 别男年 龄53技术职称药理工程师学 位专 业药理学学 校昆明医学院系、所、室省天然药物药理重点实验室详细地址昆明市人民西路191号电话5316883学位情况总人数高级中级初级学士硕士生博士生博士后参加单位数 6213主要研究内容和意义摘要（限 120 字）建立脑I/R损伤模型，应用免疫组织化学、分子生物学等技术和方法，研究灯盏花乙素抗缺血性脑损伤的作用分子机制，为临床防治缺血性脑血管疾患寻找抗损伤药物作用靶点和为我省中药灯盏花药用资源的开发和利用提供实验和理论依据，具有重要实用价值。预期目标及成果（限100 字）阐明ONOO-PARP通路在脑I/R损伤中的地位和作用；阐明灯盏花乙素抗脑I/R损伤作用的分子机制，为临床防治缺血性脑血管疾患寻找药物作用靶点和我省灯盏花乙素迈向国际市场提供科学实验和理论依据。二、申 请 项 目 经 费 预 算 表申请资助金额其 中其他经费来源 （万元）2004 年2005年200 年200 年200 年国家自然基金项目国家其他资助项目省内资助项目自筹经费 3万元3预算支出科目金 额（万元）开 支 说 明仪器设备费0.5各项指标的检测费实验材料费2.11放射性同位素试剂、荧光指示剂、分子生物学试剂、免疫组织化学试剂等科研业务费0.3动物费、水电费、文献检索费、论文发表费、会议费及Intrenet费等其他费0.09科研管理费填表说明：1.仪器设备费：指资助项目专用的简易仪器设备的购置和运杂等 费，自制设备的材料及加工费。 2.实验材料费：指科研用消耗性材料、试剂、药品等购置费，标 本、样品采集加工和运杂费。 3.科研业务费：包括动力设备和燃料试验所需的动力、燃料费， 实验用动、 植物购置、养殖费，计算机上网费、测试、分析费（使用本单位设备应不收或只收消耗费），本项目必需的调查研究、学术会议、业务资料等费。 4.其他 ：管理费不超过资助金额的3，由单位统一掌握。未签 订协议的协作费以及资助项目批准前已发生的支出，不得列入。三、研 究 项 目 组 成 员 登 记 表姓名性别年龄专业技术职 务（职称）专业工作单位在本项目中的分工每年用于本项目工作的月数签章学历雷伟亚男53工程师药理昆明医学院主持、主要完成者6王殿华男51教 授病生昆明医学院项目指导6博士杨为民女34 副教授药理昆明医学院主 要完成者6博士张恒丽女27在 读研究生病生昆明医学院主 要完成者6学士褚薇薇女28在 读研究生病生昆明医学院主 要完成者6学士谢利霞女27在 读研究生病生昆明医学院主 要完成者6学士四、 研究项目的意义、内容、目标和解决问题的方法等 一、 本研究项目的科学依据和意义（包括科学意义和应用前景，国内外研究概况、水平和发展趋势，学术思想，立论根据，特色或创新之处，主要参考文献目录和出处）研究意义近年来，随着溶栓方法、动脉搭桥术、心脏外科体外循环、断肢再移植和器官移植方法的建立和应用，缺血再灌注（Ischemia-Reperfusion，I/R）损伤仍然是造成患者死亡的重要原因。因此，对I/R发病机制的研究受到国内外界医学的高度重视。大量研究表明活性氧（Reactive oxygenspecies，ROS）在I/R损伤发病机制中起重要作用。然而，新近研究报导NO和O2反应产生的过氧亚硝酸阴离子（peroxynitrite，ONOO-）介导聚ADP核糖基聚合酶（Poly-（ADP-ribose）polymerase，PARP）活化作用可能是心肌等器官再灌注、炎症和休克等病理过程中造成组织细胞功能障碍和细胞死亡一条新的重要通路（ONOOPARP Pathway）1。目前，这一通路已成为国内外学者研究许多疾病病理发生机制的新热点。缺血性脑损伤是多种神经系统疾病（缺血性脑病、脑梗塞等）的病理学基础，近年来，对其发病机制进行了多方面的探讨，PARP作为DNA损伤的重要组成部分，在缺血性脑损伤中的作用机制研究得到广泛关注。研究报道，灯盏花素在临床上治疗缺血性脑损伤疾患等，总有效率均达到90%以上，其作用明显优于复方丹参、维脑路通等对照组。然而其确切的药物作用靶点和分子水平作用机制不清，因此研究ONOOPARP新通路在脑I/R损伤中的地位和作用，探讨灯盏花乙素抗脑I/R损伤中的作用分子机制，不仅为临床防治缺血性脑血管疾病后所造成脑损伤作用寻找抗I/R损伤药物作用的靶点提供实验和理论依据，也为我省中药灯盏花药用资源的开发和利用奠定科学实验和理论依据，创造巨大的社会和经济效益，因而具有重要实用价值。国内外研究现状PARP是广泛存在于真核细胞内的核酶，具有多种生物学作用2。在生理情况下，主要参与DNA修复和维持基因的稳定性，在转录水平上调节多种蛋白质的表达（iNOS、NF-B等），调节端粒酶的活性，清除组织严重受损的细胞等多种功能3。大量文献报道氧化应激引发PARP过度活化导致NAD和ATP减少，引起组织细胞功能障碍和细胞死亡（凋亡和坏死），在中风、心肌缺血、糖尿病及其引起的心血管功能障碍、休克、创伤性的中枢神经系统损伤、炎症等病理过程中起重要作用4。新近研究证实PARP过度活化可激活NF-B，引起细胞因子、化学趋化因子、粘附分子等炎症介质基因表达增加5。一些研究报导心肌、肠、肾、眼及骨骼肌I/R损伤中，ON00-介导PARP活化引起细胞损伤和细胞死亡，而应用PARP抑制剂3-aminobenzamide可以阻止细胞损伤和细胞死亡，提示ONOOPARP通路在I/R损伤中的作用6。DNA单链断裂被认为是诱发PARP活化作用的重要因素7。目前认为自由基氧化物特别是ONOO是DNA单链断裂的强烈作用剂8。Beckman等（1990年）首先发现ONOO具有生物学作用2最新生物化学研究证明ONOO为NO与O2的反应产物，是一种强烈的氧化剂，具有强烈的细胞毒性作用9。因而，ONOO在器官I/R损伤、内毒素性休克、炎症和动脉粥样硬化等病理过程中的作用已成为目前国外医学界研究的新热点10。有研究表明，脑缺血后，NMDA受体兴奋，Ca2+内流，从而激活NOS，引起NO释放，NO 与O2-反应生成ONOO-。此外，炎症反应，缺血再灌注及多种细胞损伤机制作用于细胞后都能产生ONOO-11。ONOO-通过攻击DNA分子中的氢原子，打开核糖的糖环，使得DNA断裂，从而激活PARP。Ischiropoulos等（1992年）发现ONOO可使蛋白质酪氨酸残基硝基化生成代谢物硝基酪氨酸（Nitrotyrosine，NT）而氧自由基、NO2-、NO及其氧化还原形式则无此作用12。目前已公认NT是ONOO-在体内生成的特异性标志物。应用免疫组织化学、分子生物学等技术检测组织细胞内有NT存在可直接证明ONOO-的作用13、4。灯盏花（灯盏细辛）为菊科短葶飞篷属科植物（Erigron brelis-capus(vaniot) Hand Mazz），产地云南，其提取物含多种黄酮类活性成分15。已证实黄酮类化合物有抗氧化作用，灯盏花素可能是通过直接清除自由基，抑制脂质过氧化16。研究表明，灯盏花素注射液可明显增加脑缺血及再灌注后ATP含量，减轻脑I/R损伤17。另外发现，灯盏花素能显著降低降低豚鼠气道上皮细胞NF-B的表达水平。据报道，灯盏花素在临床上治疗缺血性脑损伤等脑血管疾患，总有效率均达到90%以上，其作用明显优于复方丹参、维脑路通等对照组。然而，其确切的药物作用靶点和分子作用机制不清。新近研究发现，灯盏花主要有效成分为灯盏乙素（Scutellarin），其结构式为：4,5,6三羟基黄酮7葡萄糖醛酸甙18。目前对灯盏乙素药理学作用的研究开展不多，其作用机制更是少见报道，因此研究其作用及机制对灯盏花系列资源的可持续发展利用具有重要的理论和实用价值。本课题拟在脑I/R损伤模型，应用免疫组织化学、Western Blot、荧光显微镜等技术和方法，研究ONOOPARP通路在缺血性脑I/R损伤中的地位和作用，以及探讨灯盏花乙素抗脑I/R损伤中的作用分子机制，不仅为临床防治缺血性脑血管疾患后所造成脑损伤作用寻找抗I/R损伤药物作用的靶点提供实验和理论依据，也为我省中药灯盏花药用资源的开发和利用奠定科学实验和理论依据，创造巨大的社会和经济效益，因而具有重要实用价值。主要参考文献1. Szabo C. Schock.1998;9:341-3442. Beckman JS. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87:16203. De Murcia G, Schreiber V, Molinete M, et al. Mol Cell Biochem. 1994;138:15-244. Virag L, Szabo C.Pharmacol Rev.2002;54:375-4295. Oliver FJ,Menisser de Murcia J,Nacci C, et al. Eur Mol Biol Organ.1999;18:4446-44546. Zingarelli B,Cuzzocrea S,Zsengeller Z, et al. Cardiovasc Res.1997;36:205-2157. Mohnete M, Vermeulen W, Burkle A, et al. Eur Mol Biol Organ. 1993;12:2109-21178. Szabo C, Ohshima H. Nitric Oxide. 1997;1:878-8859. Ronson RS, Nakamura M, Vinten-Johansen J. Cardiovasc Res. 1999;44:47-5910. Richard BR.Life Scie. 1997;60:183311. Szabo C. Free Radio Biol Med.1996;21:855-86912. Ischiropoulos H. Arch Biochem Biophys. 1998;356:1-1113. Kamisaki Y, Wada K, Bian K. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95:11584-1158914. Souza JM, Daikhin E, Yudkoff M, et al. Arch Biochem Biophys. 1999;371:169-1715. 张人伟，张元玲，王杰生等. 中草药. 1988；19（5）：716. 淤泽溶. 中国民间民族医药杂志. 1996；22：2417. 陈小夏，何冰，杜淇璋. 中药新药与临床药理. 1998；9（4）；214-21618. 张卫东等，灯盏细辛化学成分的研究，中国药学杂志，2000，35(8)：514-516二、 研究内容和预期成果（说明研究项目的具体内容并明确重点解决的科学问题，预期成果和提供的形式。如系理论成果，应写明在理论上解决哪些问题及其科学意义；如系应用性成果或基础性资料，应写明其应用前景）研究内容1. 建立脑I/R损伤模型，观测脑组织髓过氧化物酶及用TUNEL法和荧光显微镜观测脑组织细胞凋亡形态结构的改变，评价脑I/R损伤。2. 用分子生物学技术（Western Blot）及免疫组织化学技术分别测定脑组织细胞硝基酪氨酸蛋白含量和组织定位，确定内源性ONOO-在脑I/R损伤中的作用。3. 用比色法测定NAD+和ATP水平、液闪技术测定3HNAD+水平及流式细胞仪分析技术测定NAD(eNAD)类似物及PARP抑制剂3-aminobenzamide，以评价脑组织PARP活性（见假说示意图）。4. 探讨灯盏花乙素抗缺血性脑损伤的作用机制。预期结果1. 建立脑I/R损伤模型，阐明ONOO-PARP通路在脑I/R损伤中的地位和作用。2. 阐明灯盏花乙素抗脑I/R损伤的作用分子机制，为临床防治缺血性脑损伤疾患寻找抗脑I/R损伤药物作用靶点提供实验和理论依据。3. 为我省中药灯盏花药用资源的开发和利用奠定科学实验和理论依据，创造巨大的社会和经济效益。 三、拟采用的研究方法、技术路线（包括研究工作的总体安排和进度，理论分析、计算、实验方法和步骤及其可行性论证，可能遇到的问题和解决的办研究方法1. 用SD大鼠复制脑I/R损伤模型。实验分四组（每组n=10）：（1）假手术组；（2）I90minR45min组；（3）I90minR45min组+不同浓度灯盏花乙素组；（4）灯盏花乙素组。2. 观测髓过氧化物酶（MPO）判断脑组织嗜中性白细胞扣押和脑组织炎症反应程度。3. TUNEL法及荧光显微镜观测脑组织细胞凋亡细胞形态学变化。4. 用免疫组织化学和Western Blot 技术分析ONOO-特异性标志物硝基酪氨酸在脑组织定位和细胞中的含量。5. 比色法测定NAD+和ATP水平、液闪技术测定3HNAD+水平及流式细胞仪分析技术测定NAD(eNAD)类似物和应用PARP抑制剂3-aminobenzamide，观测PARP活性。 技术路线1.建立脑I/R损伤模型，用以评价ONOO-PARP通路在脑I/R损伤和探讨灯盏花乙素抗脑I/R作用机制。2.用分子生物学技术（Western Blot）和免疫组织化学技术，确定内源性ONOO-在脑I/R损伤中的作用。3.用比色法、液闪技术及流式细胞仪分析技术和用PARP抑制剂3-aminobenzamide，评价PARP活性。年度总体安排和进度： 1.2004.102005.10 建立脑I/R损伤模型，观测髓过氧化物酶（MPO）判断脑组织 嗜中性白细胞扣押和脑组织炎症反应程度。TUNEL法及荧光显微镜观测脑组织细胞凋亡细胞形态学变化。免疫组织化学和Western Blot 技术分析ONOO-特异性标志物硝基酪氨酸在脑组织定位和细胞中的含量。 2.2005.102006.10 比色法测定NAD+和ATP水平、液闪技术测定3HNAD+水平及 流式细胞仪分析技术测定NAD(eNAD)类似物和应用PARP抑制 剂3-aminobenzamide，观测PARP活性。发表论文，申报科研成 果鉴定。聚ADP核糖基聚合酶在脑缺血-再灌注损伤中的作用假说示意图Cerebral Ischemia Reperfusion ONOO- ? NO O2- DNA strand breaksPARPactivation 灯盏花乙素 ？ 3-aminobenzamideTissue Damage/Cell Death 代表阻断或清除 ？ 代表本项目拟解决的内容 四、 现本项目预期目标已具备的条件（包括过去的研究工作基础，现有的主要仪器设备，研究技术人员及协作条件，从其他渠道已得到、已申请或拟申请的经费情况及金额等）研究资料表明ONOOPARP通路在中风、脑I/R损伤、创伤性的中枢神经系统损伤、炎症等病理过程中起重要作用。据报道，灯盏花素在治疗冠心病、心绞痛、脑血管疾患等总有效率均达90%以上，其作用明显优于复方丹参、维脑路通对照组，因而本课题研究在工作假说上是可行的。本项目申请者所在实验室已建立了大鼠脑I/R损伤的模型，掌握有关本实验研究的技术和方法，具有深厚的工作基础。本项目主要成员业务素质高，搭配合理。研究的基本设备已具备齐全，可保证本课题顺利完成。五、 申请者和项目组主要成员业务简历（按人填写主要学历和研究工作简历，近期发表的与本项目有关的主要论著目录和科研成果名称，并注明出处及获奖情况。如承担过科学基金资助项目，应写清楚完成情况和国内外评价、引用及应用情况）雷伟亚 药理工程师 昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室 本研究项目负责人，负责实验设计、计划案排和部分关键实验。申请者自1975年以来，一直从事药理研究及新药研究开发工作，掌握扎实的药学理论基础知识，具备较强的独立从事科研工作能力。1985年主持研究新药（七叶神安片），该药已列入国家基本药物，进入国家药典。该药物自1986年投产以来,在云南、广西已有20余家药厂生产,累计产值达5亿元。曾参加我省中药三七、灯盏花等多项研究工作。参与完成撰写云南中药志工作。曾获得云南省科学进步三等奖和云南省药物研究一等奖。 发表论文：1. 三七叶总皂甙对中枢神经系统的抑制作用。中成药，1982；（8）：372. 三七皂甙E对中枢神经系统的抑制作用。中草药，1986；17（1）：153. 人参皂甙Rg1对中性粒细胞与血小板之间黏附的影响。中草药，2002；33（2）：1384. 灯盏花总黄酮对血小板聚集和血栓形成的影响。天然药物与开发，2000；12（1）：22王殿华 教授 博士 博士生导师 作为本研究项目指导者。1993年攻读博士期间开始从事申请者休克与细胞凋亡的研究，已掌握了细胞培养、免疫组织化学、流式细胞仪分析和分子生物学等多项技术和方法。1998年主持国家自然科学基金资助（PMN凋亡在急性肺损伤中的作用及NF-B对其调控的研究，39770311），已结题，评定为国内先进水平。1999主持完成河北省自然科学基金资助项目（ONOO-Poly-(ADP-ribose)合成酶通路在肺I/R损伤中的作用，399352）。2001年主持云南省自然科学基金资助项目（用基因芯片研究氧化应激对血管内皮细胞调节作用的分子机理，2001C0047M），正在进行中，部分实验已完成，可如期完成任务。2002年主持国家教育部科学技术研究重点项目（NF-B调控ONOO-介导的PMN凋亡对肺I/R损伤的防治作用，地方01121），正在进行中。2003年主持云南省自然科学基金项目（核因子-B对血管内皮细胞表现形式的信号转导作用，2003C0052M），2003年主持云南省自然科学主任基金项目（治疗SARS云南产中成药物筛选研究，2003C0003R）。曾三次获河北省科学进步三等奖。近年发表相关论文：1.The protective effect of anisodaminc against thymic apoptosis induced by lipopolysaccharide.Shock.1996；（5）：1292.NO与O2-同时生成对离体兔肺动脉反应性影响的初步研究. 河北医科大学学报.1999；20（3）：3213.内毒素诱导兔肺动脉平滑肌iNOS表达中NF-B作用的探讨. 中国应用生理学杂志. 1999；15（2）：974.平阳霉素诱导大鼠肺纤维化过程中肺泡巨噬细胞增殖和凋亡的实验研究.中国病理生理杂志 2000；16(10)：11005.一氧化氮对大鼠肺泡巨噬细胞增殖、凋亡及细胞内Bcl-2和Bax含量的影响.中国病理生理杂志. 2000；16（10）：11016.IL-10影响人PMN凋亡及p53、BCL-2蛋白表达的实验研究.河北医科大学学报 2000；21（1）：17.IL-10影响人PMN凋亡及p53、BCL-2蛋白表达的实验研究.河北医科大学学报 2000；21（1）：18过氧亚硝基阴离子在哮喘豚鼠气道高反应性中的作用. 中华结核和呼吸杂志.2000；23（9）：538杨为民 副教授 硕士 2000年开始攻读中科院昆明植物所生物学专业博士学位。1991年以来，一直从事药理研究及新药研究开发工作，掌握扎实的药学理论基础知识，具备较强的独立从事科研工作能力，曾参加滇产毛喉鞘蕊花提取成分对离体肺条、气管条作用及抗青光眼作用研究，阿斯匹林铜抗炎及对细胞粘附作用的影响及其分子机制研究，以及多项心血管药理研究项目。近年发表相关论文1.灯盏花素总黄酮对沙土鼠短暂性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用. 天然产物研究与开发