MS培养基的制备--mzm.doc

实验一、MS培养基的配制一、实验目的 通过掌握MS培养基的制备和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件。在配置培养基之前，为了方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配置培养基时，只需按预先计算好的量吸取母液。二、实验原理 培养基是离体植物细胞、组织和器官吸取营养的场所。在植物细胞的分裂和分化过程中，需要各种营养物质，这些营养物质包括无机营养成分、有机营养成分、植物生长调节物质等。在对植物的器官、组织和细胞进行离体培养时，只是切取植物体的一小部分，它们无法象整体植株那样合成生长发育所需的全部物质。而自然界的植物千差万别，每一种植物都有自己独特的生理代谢过程和各自的营养需求，没有哪一种培养基能够适用于所有植物。因此，对培养基组成成分的筛选是非常重要和必不可少的程序。目前对植物进行组培时，人们所使用的培养基只几十种，其中MS培养基应用最为广泛。说明MS培养基的无机盐成分对许多植物种均是适宜的，它的无机盐含量较高，微量元素种类较全，浓度也较高。三、实验试剂与仪器设备1、药品试剂：母液、蔗糖、琼脂、NaOH溶液、HCl溶液、无菌水、NAA、6-BA、2，4-D等。2、仪器设备：电子天平、量筒、PH试纸、培养瓶、高压灭菌锅、移液管、洗耳球、玻璃棒、药勺等。四、实验内容（一）母液的配制MS培养基母液方案配制如下表：成分1L母液的用量(mg/L)每升培养基取用量(ml)备注大量元素(20X)NH4NO33300050KNO338000KH2PO43400MgSO47H2O7400CaCl2880050单独配制铁盐(200X)FeSO4.7H2O55605Na2-EDTA7460微量元素（200X）KI1665H3BO31240MnSO4.H2O4460ZnSO4.7H2O1720NaMoO4.2H2O50CuSO4.5H2O5CoCL2.6H2O5有机元素(200X)VB1205VB6100烟酸100甘氨酸400肌醇20000具体配制步骤如下：1、大量元素母液的配制 无机盐中大量元素母液，按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大20倍，用感量为0.01g的扭力天平，分别用50mL烧杯称量，用重蒸馏水溶解.溶解时在每只烧杯中加入30-40mL重蒸馏水，置于酒精灯上,加热使其溶解(注意温度不可过高，60-70)。溶解后，在1000mL量筒中，混合后用重蒸馏水定容到1000mL。其中CaCl2单独配制，而且在混合母液时CaCl2应最后加入，以免形成沉淀。将配好的母液倒入细口瓶中，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，配1000mL培养基取此母液50mL。2、微量元素母液的配制无机盐中微量元素母液，按照培养基配方用量的200倍，用微量0.0001g的电光分析天平，分别用50mL烧杯称量，用重蒸馏水溶解。混合定容于100ml容量瓶中保存于冰箱中,配制培养基时，每配制1000mL培养基取此母液5mL.3、铁盐母液的配制无机盐中铁盐母液，按照培养基配方用量的200倍，用感量0.01g的扭力分析天平，分别用50mL烧杯称量，用重蒸馏水溶解，混合定容，倒入细口瓶中，每配制1000mL培养基取此母液5mL。4、有机元素的配制无机盐中有机元素母液，按照培养基配方用量的200倍，用感量0.01g的扭力天平，分别用50mL烧杯称量，用重蒸馏水溶解，混合定容，倒入细口瓶中，每配制1000mL培养基取此母液5mL。5、母液澄清，无沉淀，说明配制成功，可以储存起来。6、植物激素的配制 0.1mg/mL 的6-BA溶液：取10mg的6-BA，用少量1N的盐酸溶解，再加蒸馏水定容至100mL。0.1mg/mL的NAA：取10mg的NAA可溶于热水中或用少量95%乙醇或少量1N的NaOH溶解后，再加水定容至100mL。0.1mg/mL 的2,4-D溶液：取10mg的2,4-D，用少量无水乙醇溶解，再加蒸馏水定容至100mL。（二）MS培养基的配制和灭菌1、培养基的配制按照MS培养基的配方（以配制1LMS培养基为例）取大烧杯加入先前配制好的母液其中包括：大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐5ml、有机元素5ml，植物激素各2ml最后加钙盐50ml充分混匀。再加入30g蔗糖，然后与刚溶解的琼脂（7g）混合，加入适量的去离子水使总量定容至于1L，混匀后调PH值（调至5.8-6.0）。分装，每100mL三角瓶装40mL，共装25瓶。最后用组织培养用封口膜封上，扎紧后灭菌 。2、培养基灭菌将分装好的培养基放在高压灭菌锅中，加热，待压力上升到0.5kg/cm2时，排净冷空气，关闭放气阀继续加热使压力稳定在1.2kg/cm2，温度为121的条件下，维持15-20分钟。五、注意事项1、配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+和S042-，Ca2+、Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。2、配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。3、药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。4、药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。5、一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。5、母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。6、配制铁盐母液时，FeS04和Na2EDT