肿瘤学常用实验技术考题整理.doc

1、组织培养中常见污染的种类和途径凡混入培养环境中对细胞生长有害的成分或造成细胞不纯的异物微生物：细菌、真菌、病毒、支原体；细胞以及化学物；途径：空气；操作过程；血清；组织本身；清洗消毒不彻底2. 在DNA重组中常用的工具酶及如何在DNA重组中应用它们？（1）限制性内切酶：识别特异序列，切割DNA（2）DNA连接酶：催化DNA中相邻的5磷酸基与3羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合，连接DNA片段（3）DNA聚合酶：a.合成双链cDNA中第二条链； b.缺口平移制做探针；c.DNA序列分析；d.填补3末端；（4）Taq酶 催化PCR反应，聚合DNA。（5）反转录酶 a.合成cDNA；b.替代DNA聚合酶进行填补，标记或DNA序列分析；（6）多聚核苷酸激酶 催化DNA 5羟基末端磷酸化，或标记探针；（7）碱性磷酸酶 切除DNA5末端磷酸基；（8）末端转移酶 在3羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾；（9）DNA酶：切割DNA；（10）RNA酶：切割RNA；3. 双向电泳的定义及基本步骤 双向电泳是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行水平方向的等电聚焦电泳，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；再进行垂直方向的SDS-PAGE，使蛋白质按分子量大小得到分离，经染色得到二维分布的蛋白质图。基本步骤：（1）样品制备：目标是尽可能扩大蛋白样品的溶解度和解聚。细胞样品：直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白；组织样品：液氮中研碎组织，用三氯乙酸丙酮沉淀蛋白，再用裂解液复溶；体液样品：去除高丰度蛋白，三氯乙酸丙酮沉淀蛋白，再用裂解液复溶；（2）Brandford法蛋白定量：考马斯亮蓝G-250 在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值，且595nm的光吸收值与蛋白的含量成正比。（3）第一向等电聚焦电泳：pH梯度的选择要先宽后窄，先短后长，先线性后非线性；（4）平衡：使被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS-PAGE顺利进行。（5）SDS-PAGE（6）考马斯亮蓝染色或银染；（7）图像采集和分析。 4.在流式细胞实验中，设置阴性对照、同型对照、荧光补偿对照的作用及如何设置?同型对照：由于抗体与细胞间存在非特异性结合（电荷间互吸等），流式抗体与细胞结合时有特异性结合和非特异性结合，同型对照用于消除非特异结合所至非特异染色。如荧光素FITC标记兔抗人CD34抗体IgG的同型对照应该是荧光素FITC标记兔抗人IgG。阴性对照：用于消除实验细胞本身的自发荧光，可将上述的同型对照作为阴性对照。荧光补偿对照：荧光补偿是指修正荧光光学信号在探测器之间相互渗漏并被数字化检测的过程。荧光补偿对照：在双色系统中选用原样本进行一种荧光素的单染，用于检测荧光补偿调节是否正确。5. 运用流式细胞技术如何从一种组织或细胞系中寻找肿瘤干细胞.SP细胞：SP细胞被认为是肿瘤干细胞，其特征是能将细胞染液Hoechst泵出细胞；ALDH法：增殖能力高的细胞，醛脱氢酶高；肿瘤干细胞表面有特殊的肿瘤标志物如CD133；6. 抗原修复的方法及非特异性染色的消除方法真空负压抗原修复法；微波辐射抗原修复法；高压抗原修复法；蛋白酶消化法。非特异性染色的消除：a、透析，荧光素可以通过半透膜，而蛋白质分子不能透过，可将位于蛋白结合的荧光素透析出去； b、葡聚糖凝胶G-50柱层析法，分离荧光抗体试剂中游离荧光素； c、DEAE纤维素柱层析法，除去标记过多或过少荧光素的抗体分子； d、荧光抗体稀释法，减少非特异性结合，增加特异性结合； e、纯化抗原法，用各种方法提纯单一成分的抗原以制备单价特异性抗体；7、免疫组化的优点免疫组化利用抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原，并对其进行定位、定性及定量的研究。其优点有：特异性强，敏感性高，定位准确，形态与功能相结合。8、实验动物和动物实验的概念，常用实验动物的分级及屏障环境所需控制的基本条件实验动物：经人工培育，对其携带的微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清除的，用于科学研究、教学、生产以及其他学科实验的动物。动物实验：在实验室内，为了获得有关生物学、医学和其他学科新的知识或解决具体问题而使用动物进行科学研究的行为。常用实验动物分为普通级动物，清洁级动物，无特定病原体动物，无菌动物。屏障环境所需控制的基本条件：温度2026度，相对湿度4070，压强2050Pa，气流速度1.52.5m/s，换气次数1020次/h,噪声不超过60dB。9、激光扫描共聚焦荧光显微镜的定义及成像原理及应用领域中常用的几种技术，列举两项定义：激光扫描共聚焦荧光显微镜采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的显微镜系统。成像原理：激光电光源照射样本并激发荧光，该荧光沿原照射光路回送到分光器，分光器将荧光直接送到探测器，激光逐点扫描样品，探测器中的光电倍增管逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机并最终形成整个平面的共聚焦图像。应用：a、荧光漂白恢复，某一区域的荧光分子被激光照射后，荧光分子的化学结构被破坏，不再发荧光即发生光漂白，但被照射区域随着周围荧光分子运动至此处而荧光逐渐恢复。因此荧光漂白恢复率及荧光漂白恢复速率可以代表分子的运动速度。b、荧光能量共振转移：激发态荧光素将能量传递给另一种荧光素，使后者被激发，这一过程称为荧光能量共振传递。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。能够发生转移的条件有受体与供体的距离10nm；供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠。10、PCR的基本原理PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸。11、基因芯片的概念及应用领域基因芯片（gene chip）又称DNA芯片、DNA微阵列芯片或寡聚核苷酸芯片，采用大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于玻璃或尼龙基底等支持物上，形成二维阵列，与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，从而检测特定基因。应用：a、基因表达分析：利用基因芯片可敏感地定量、定性检测基因表达水平，且能同时研究同一组织中成千上万个基因的表达情况，为疾病的诊断和治疗提供有益信息； b、DNA序列分析； c、基因点突变及多态性检测； d、寻找新基因设计实验对照的原则为齐同可比，即在实验体系中，除被研究对象外，其他条件均应保持一致。12、质谱的概念和组成及质谱在蛋白质组学的应用包括哪些方面？质谱是带电原子、分子或分子碎片按质荷比的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子离化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。应用：蛋白质和肽段的鉴定；蛋白质翻译后修饰的鉴定；定量蛋白质组学；蛋白质间连锁图13、变性高效液相色谱（DHPLC）有几种操作模式，各种操作模式的主要用途？非变性条件下DHPLC可分离分析双链核苷酸片段，微卫星检测，基因杂合性缺失检测；部分变性条件下DHPLC可根据同源、异源双链DNA解链特征的差异进行变异检测；完全变性条件下DHPLC可用于分离分析单链核酸片段。14、用DHPLC进行基因突变检测或基因多态分析的主要步骤，DHPLC具有哪些特点？a、DNA的分离和提取；b、引物的选择和设计；c、PCR扩增；d、WAVE系统分析；e、测序分析DHPLC 的特点1）快速分离DNA分子（一个样品约需8.8分钟）2）自动化程度高3）准确测定DNA片段大小4）基因突变检出率高（达95-100%）5）经济、操作简便、PCR产物无须进行纯化处理即可用于突变检测15、分离蛋白质的方法有哪些？（1）利用溶解度差异的分离方法：盐析；（2）根据分子量和分子大小不同的分离方法：a、离心；b、透析和超滤，是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质,使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开；c、凝胶过滤层析；（3）根据电荷不同的分离方法：a、电泳；b、离子交换层析；（4）亲和层析法：亲和层析是利用生物大分子所具有的特异性亲和能力进行分离的方法；（5）高效液相层析；16、盐析法沉淀蛋白质后常用透析法去除其中的盐分，你认为还可用什么方法脱盐，为什么？凝胶过滤：利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的