突变体质粒构建—PCR法-2011.doc

实验题目：突变体质粒构建PCR法背景与原理：蛋白与蛋白间，蛋白与核酸间相互作用是后基因组学研究重要内容之一，而体外突变技术则是研究这种复杂关系的一个有效手段。通过PCR方法可向目的DNA片段中引入任何所需的变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。PCR定点突变迅速、高效并且重复性好，是基因研究工作中一种非常有用的手段。其基本原理可简述如下图：产物I产物II第一轮PCR第二轮PCR退火延伸8个循环后加入引物1/引物4本实验拟在某基因编码区（CDS）内，通过PCR定点突变引入一个EcoRI酶切位点。该基因片段长724bp，上下游分别以XhoI和BamHI两个酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1，即pcDNA3.1-CDS。此基因内部含有一个EcoRI酶切位点，我们通过PCR法诱变又形成一个EcoRI酶切位点，可以通过EcoRI单酶切验证突变是否成功。具体设计如下：仪器、试剂及药品配方：1. 仪器：PCR仪，电泳槽，水浴锅，凝胶成像仪，离心机，振荡培养箱，温箱，超净工作台，冰箱2. 试剂及配方：2.1 试剂：DNA回收试剂盒，限制性内切酶（BamHI，EcoRI，XhoI），T4连接酶，DNA电泳marker2.2 PCR反应体系：primex12.5l模板1l上游引物（5M）2l下游引物（5M）2l水7.5l2.3 primex配制：primexTaq酶0.125l10Taq酶buffer2.5ldNTP（2.5M）2l水7.875l2.4 DNA电泳buffer（TAE）：工作液（1）储存液（50）40mM Tris-乙酸242g Tris/57.1ml冰乙酸1 mM EDTA100ml 0.5M EDTA（pH8.0）2.5 LB液体培养基（1000ml）蛋白胨10g酵母抽提物5gNaCl5g2.6 LB固体培养基（100ml）蛋白胨1g酵母抽提物0.5gNaCl0.5g琼脂粉1g3. 实验方法：3.1 PCR制备突变体片段：3.1.1第一轮PCR反应体系：反应I反应IIprimex12.5l primex12.5l模板1l模板1l引物1（5M）2l引物3（5M）2l引物2（5M）2l引物4（5M）2l水7.5l水7.5l反应条件：941min9430S30循环551min7230S725min3.1.2 第二轮PCR反应体系：primex12.5l产物I23l产物II23l引物1（5M）2l引物4（5M）2l水补足至25l注：引物1/引物4在PCR反应进行8个循环后加入。反应条件：941min9430S35循环（第8个循环后暂停加入引物）551min7230S725min3.2 凝胶回收：a. 配制琼脂糖凝胶；b. DNA琼脂糖凝胶电泳；c. 紫外灯下截取相应的DNA片段凝胶，置于1.5ml dorf 管内；d. 每管加入500l 溶液A，55水浴融化10min，其间可振荡助融2-3次；e. 融化后，每管加入15l 溶液B，混匀，加入离心柱；f. 离心12000rpm，30s；g. 弃下管液，每管加入500l 溶液C，离心12000rpm，30s；h. 重复步骤g（弃下管液，每管加入500l 溶液C，离心12000rpm，30s）i. 弃下管液，离心12000rpm，30s；j. 将离心柱置于新的dorf管中，室温敞开离心管盖2-3min，每管加入25l 溶液D，室温放置2min；k. 离心12000rpm，1min。3.3 酶切体系：3.3.1构建质粒酶切体系：酶切片段酶切载体片段10l pcDNA3.1质粒10lBamHI1.5lBamHI2.5lXhoI1.5lXhoI2.5l10K6l10K6l水41l水39l3.3.2酶切验证体系：酶切体系I酶切体系II质粒11.5l 质粒11.5lBamHI0.25lEcoRI 0.25lXhoI0.25l10K1l10H1l水补足至10l水补足至10l3.4 连接体系：载体（100ng）l片段（68ng）lT4连接酶0.5l10buffer1l水补足至10l3.5 制备感受态：a. 取培养的菌液1ml转至100ml LB液体培养基，菌体振荡培养至OD6000.35（可凭经验）；b. 将100ml菌液转至两个冰预冷的灭过菌的50ml离心管内，冰浴10ml；c. 离心，4 4000rpm，10min；d. 弃上清，每管加入10ml 冰预冷的灭过菌的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀；e. 离心，4 4000rpm，10min；f. 弃上清，每管加入2ml 冰预冷的灭过菌的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀，再分别加入2ml灭过菌的40甘油，混合均匀；g. 按每管150l分装，-80贮存备用。3.6 转化：a. 超净工作台内，将连接体质粒加入感受态细胞，冰浴30min；b. 热击，42，90秒；c. 冰浴12min；d. 超净工作台内，加入800l LB液体培养基，振荡预培养50min；e. 离心，8000 rpm，1.5min，弃上清，余100l左右，吹散沉淀；f. 涂布LB固体培养基平板，37正置培养1h；g. 翻转平板倒置培养过夜。3.7 小提质粒：a. 离心收集菌体，12000rpm，30S；b. 弃上清，150l 溶液I（25mM Tris-Cl，10mM EDTA）重悬菌体；c. 加入150l 溶液II（2SDS：0.4M NaOH 1：1）轻混；注：溶液II现用现配。d. 加入150l 溶液III轻混；乙酸钾（5M）60ml冰乙酸11.5ml水28.5mle. 离心，12000rpm，5min；f. 收集上清至新管，加入等体积酚：氯仿（1：1），振荡；g. 离心，12000rpm，5min；h. 移上清至新管，二倍体积无水乙醇沉淀20min；i. 离心，12000rpm，10min；j. 弃上清，室温干燥，20l TER溶解；k. 电泳验证。日程安排：第一组第二组周六1. 第一轮PCR；2. 分别将反应I与反应II的产物进行2琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶回收试剂盒说明书分别回收得到产物I（446bp）与产物II（314bp）。3. 通过2电泳验证回收效率（上样量：2l）。4. 第二轮PCR；5. 电泳回收（产物736bp）及验证。周日晚： 6：008：00酶切载体及片段1. 第一轮PCR；2. 分别将反应I与反应II的产物进行2琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶回收试剂盒说明书分别回收得到产物I（446bp）与产物II（314bp）。3. 通过2电泳验证回收效率（上样量：2l）。4. 第二轮PCR；5. 电泳回收（产物736bp）及验证。6. 酶切载体及片段周一9：4012：001. 回收载体：1琼脂糖凝胶电泳，切取相应大小片段，应用试剂盒回收载体DNA。2. 回收片段：二倍体积无水乙醇加1/9体积小提溶液III（醋酸钾），沉淀20min，离心，12000rpm，10min；弃上清，室温干燥，1520l TE溶解。3. 电泳验证19：1020：30连接15：1017：001. 回收载体：1琼脂糖凝胶电泳，切取相应大小片段，应用试剂盒回收载体DNA。2. 回收片段：二倍体积无水乙醇加1/9体积小提溶液III（醋酸钾），沉淀20min，离心，12000rpm，10min；弃上清，室温干燥，1520l TE溶解。3. 电泳验证。周二17：3021：30转化17：3021：30连接周三17：3019：30挑菌17：3021：30转化周四17：3019：30小提质粒17：3019：30挑菌周五15：1021：301. 电泳小提质粒样品；2. 酶切质粒。15：1021：304. 小提质粒及电泳验证；5. 酶切质粒周六8：00电泳验证14：00电泳验证实验结果及讨论：2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp446bp图1：产物I 电泳2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp314bp图2：产物II 电泳2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp446bp图3：产物I 电泳回收2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp314bp图4：产物II 电泳回收736bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图5：全长突变片段电泳2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp736bp图6：全长突变片段电泳回收6623bp4254bp5427bp图7：载体酶切电泳2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp736bp图8：片段醇沉回收6623bp4254bp5427bp图9：载体酶切电泳回收2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp5427bp736bp图10：BamHI/XhoI双酶切验证 2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp245bp5918bp图11：EcoRI单酶切阳性结果 2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp6163bp图12：EcoRI单酶切阴性结果注意事