免疫组化实验步骤.doc

免疫组化实验步骤 2013.12.免疫组化实验方法器材:微波炉 格兰仕家用微波炉光学显微镜 OLYMPUS显微镜染色缸21个，1000ml烧杯1个，保鲜膜，湿盒 试剂：封闭用血清，DAB染液，SABC试剂盒，中性塑胶 武汉博士德生物工程公司无水乙醇，甲醇，二甲苯，柠檬酸，柠檬酸钠，盐酸，氨水，氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，吐温-20，30%双氧水，苏木素染液试剂配制：1. 5PBS（1000ml）：NaCL：40g； KCL：1.2g；Na2HPO4：18.15g；KH2PO4：1.2g溶于ddH2O中定容至1000ml，调PH至 7.4-7.6。使用时稀释5倍至1使用。2. 5PBST（1000ml）：NaCL：40g； KCL：1.2g；Na2HPO4：18.15g；KH2PO4：1.2g，tween-20:2.5ml溶于ddH2O中定容至1000ml，调PH至 7.4-7.6。使用时稀释5倍至1使用。3. 柠檬酸盐缓冲液：（10mM，PH6.0）： 10储备液配制: 柠檬酸溶液：21.01g柠檬酸溶于1000ml H2O中得0.1mol/L柠檬酸溶液 柠檬酸钠溶液：29.41g柠檬酸钠溶于1000ml H2O中得0.1mol/L柠檬酸钠溶液 取190ml柠檬酸溶液加810ml柠檬酸钠溶液混合调PH至6.0得10柠檬酸盐缓冲液，使用时稀释10倍至1使用。4. 梯度酒精： 无水乙醇：取500ml无水乙醇至染色缸中，脱水和复水各3份共需6份 95%乙醇：取475ml无水乙醇加25ml水至染色缸中，脱水和复水各3份共需6份 70%乙醇：取350ml无水乙醇加150ml水至染色缸中，脱水和复水各1份共需2份5. 0.5%盐酸酒精： 0.5ml盐酸加入99.5ml 70%酒精实验步骤：1. 取石蜡切片于烤箱中55-60烘烤1-1.5h使石蜡熔化2. 二甲苯脱蜡：将烤箱中取出的切片迅速置于二甲苯染色缸中脱蜡3min3次3. 系列酒精复水：将脱蜡完成后的切片分别置于无水乙醇2min3次，95%乙醇2min3次，70%酒精2min；蒸馏水中轻晃漂洗2min。4. 抗原修复：切片置于10mM柠檬酸盐缓冲液中95以上修复，具体时间视不同组织不同切片质量决定。注意不可长时间沸腾，以免导致脱片。实验室现用格兰仕家用微波炉设置条件：取600ml柠檬酸盐缓冲液，power1加热7min后溶液沸腾，调制power 60继续加热13min，在power60条件下可保证缓冲液温度达到要求但不长时间沸腾，在加热过程中使用保鲜膜封闭烧杯口并在保鲜膜上用针头扎孔，以免加热过程中缓冲液蒸发导致浓度改变。5. 自然冷却至室温，ddH2O流水冲洗10min。注意:室温自然冷却，流水冲洗保证柠檬酸盐缓冲液不残留，残留可能导致后续实验受到影响6. 使用与二抗来源相同的封闭血清37湿盒中封闭1h。滴加血清前可使用免疫组化笔在载玻片上画圈以保证血清或抗体不会扩散7. 甩去封闭液滴加一抗4湿盒过夜孵育。一抗浓度按照说明书推荐使用封闭血清稀释使用8. 一抗过夜孵育后PBST摇床漂洗5min，PBS摇床漂洗5min4次9. 按照说明书推荐浓度滴加相应二抗37湿盒孵育20-30min，PBS摇床漂洗5min3次10. 3%H2O2封闭10min去除内源性过氧化物酶。清水漂洗后PBS 3min3次。注意：3%H2O2现配现用。时间不宜过长11. 滴加SABC后37湿盒孵育20min，PBST摇床漂洗5min4次，PBS 5min2次12. DAB染色：按照说明书要求现用现配DAB染液滴加至组织处于镜下观察染色，阳性染色出现后自来水冲洗后PBS漂洗2min。13. 苏木素复染：滴加苏木素至玻片上染色，染色时间视苏木素质量决定。染色后自来水冲洗完全去除苏木素14. 盐酸酒精分化及氨水返兰：苏木素染色在酸性条件下呈现棕色，在碱性条件下呈现蓝色。分别调整盐酸酒精分化及氨水返兰时间使苏木素染色为淡蓝色。15. 脱水封片：按照与脱蜡复水反向顺序进行脱水，脱水后使用中性树胶封片。16. 镜检：待封片干燥后显微镜下观察。注意事项：1. PBS浓度与PH值：使用PBS工作液浓度为1，PH：7.4-7.6；浓度过高或PH偏酸不易于染色且易导致背景较高。2. 切片质量不佳较易脱片时一抗4孵育过夜后可37复温30min，但易导致背景较高。3. 封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液要求PH值为7.4-7.6.4. 封闭血清应应与二抗种属相同，可减少非特异性背景染色5. 在实验过程中封闭以后干片会使背景加深。6. 苏木素复染后氨水返蓝过程会使背景及阳性染色有所降低，因此DAB染色时可以适当延长染色时间。7. 显微镜下观察时使用自然光进行观察，尽量不要使用软件补光。8. 在进行荧光染色时可以忽略H2O2封闭过程9. 如不采用SABC法，则H2O2封闭