奶牛微生态制剂中几种益生菌生物学特性的研究.pdf

畜 牧 与 饲 料 科 学 3810 微生态制剂具有增强动物机体免疫力 生物 颉颃 维持肠道微生态平衡 产生有益代谢产物等 多种功能 且具有不残留 不产生耐药性等优点 因此 用微生态制剂来增强奶牛的免疫力和抗病 力 可达到防治隐性乳房炎的目的 笔者选择了 株酿酒酵母 产朊假丝酵母 嗜酸乳杆菌 地衣芽 孢杆菌 丙酸丙酸杆菌共1株益生菌 准备用于研 制防治奶牛隐性乳房炎的微生态制剂 试验材料 菌种 试验菌种 地衣芽孢杆菌 固体培养基 在液体培养基中加入3 2 LM L 琼脂粉 先将CC63菌用上述液体培养基在试管内 传 代 每一代在N4 O温箱培养35M 7 然后 接入200 B三角瓶内 内装300 B上述液体培 养基 在N4 O温箱内培养35M 7 后 从三角瓶 中取3 B培养液 用灭菌生理盐水做3063 306 306N 3067 3062 3061 3064稀释 取3067 3062 3061稀释 度的稀释液各0 B 加入到灭菌平皿中 每个稀 释度加N个平皿 然后加入冷却到72 O左右的 CCE固体培养基 摇匀 待凝固后 置于N4 O温箱 培养35M 7 等长出菌落后 进行菌落计数 单个菌株的毒性检验 将DE63 DE6 EF63在ICD固体斜面培养基 上传代 次 每一代在N0 O温箱培养 7MN1 后 用灭菌生理盐水把斜面上的菌苔冲洗下去 用 麦氏比浊管调整菌液浓度 制成每毫升含菌约20 摘要 该试验对益生菌酿酒酵母 产朊假 丝酵母 嗜酸乳杆菌 地衣芽孢杆菌 丙酸 丙酸杆菌的生物学特性进行了研究 试验 结果表明 这几种益生菌可以用于研制防 治奶牛隐性乳房炎的微生态制剂 关键词 益生菌 生物学特性 微生态制剂 中图分类号 P8N8 84 D525 N4 1 文献标识码 Q 文章顺序编号 314 62380 001 0260003602 试验研究 9 8 畜 牧 与 饲 料 科 学 下培养5 然后 将培养液3 666 A 离心16 弃掉上清液 用 灭菌生理盐水将菌液稀释 并用麦氏比浊管调整 菌液浓度为每毫升含菌76亿个的菌液 备用 将98 5和BB 1菌分别用营养琼脂斜面和 BBC固体斜面传5代后 用灭菌生理盐水把斜面 上的菌苔冲洗下去 用麦氏比浊管调整菌液浓度 制成每毫升含菌约76亿个的菌液 备用 取37只体重为1DE55 F的小白鼠 随机分成 组 每组7只 其中一组作为对照组 给每只小白 鼠腹腔注射1 8生理盐水 其余2组作试验组 分别给每组内的小白鼠腹腔注射制备好的2种菌 的菌液1 8 连续观察 G 98 5 89 1 BB 1菌的抑菌试验 指示菌的培养 将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在营养琼脂斜 面培养基上传代3次 然后用灭菌接种环挑取指 示菌5E3环置于已灭菌装有玻璃珠的三角瓶中 并用灭菌生理盐水稀释 用麦氏比浊管调整菌液 浓度 使菌液含菌数为162个H 8 备用 试验菌株的培养 将BB 1 98 5菌分别在BBC固体斜面培养 基和营养琼脂斜面培养基上活化3代后 每一代 在3 温箱培养1DE5 用灭菌生理盐水将斜 面上的菌苔冲洗下来 用麦氏比浊管调整菌液浓 度 配制成每毫升含菌数为162个的菌液 备用 将89 1菌先在脱脂乳中活化一代 然后在液 体 温箱培 养1DE5 后 将培养液3 666 A 离心16 取上清液 备用 抑菌活性的测定 在直径I6 培养皿中加56 8灭菌的营养 琼脂培养基 凝固后 用微量移液器分别吸取605 8 指示菌悬液于平皿中的固体培养基上 用灭菌推 棒涂抹均匀 在每个平皿中等距离放置牛津杯 直 径D 个 每个牛津杯中加入566 8 98 5和 BB 1菌液及89 1菌培养液上清液 在3 温箱 中培养1DE5 若在牛津杯周围出现明显抑菌 圈 则表明菌液或菌的代谢产物具有抑菌活性 即 可用游标卡尺测量抑菌圈的直径 耐酸碱试验 98 5 BB 1菌的耐酸碱试验 98 5 BB 1菌的培养 将98 5 BB 1菌 分别在营养琼脂斜面 BBC斜面上培养3代 每一 代在3 温箱培养1DE5 调培养基的 J值 配制营养肉汤和 BBC液体培养基各1 566 8 分别分装到11个 小输液瓶中 用酸度计初步调 J值分别为107 506 306 06 706 707 06 D06 I06 16 然后高压灭 菌 灭菌后 用酸度计精确调 J值分别为107 506 305 06 706 70 06 D01 I06 16 分 装 到 小 试 管 中 每个试管装3 8 灭菌后调 J值时 要严格 执行无菌操作 耐酸碱的测定 以 J值为 06的培养基 为对照组 将活化好的菌接入上述不同 J值的培 养基中 在3 温箱培养D 后 将试管内培养液 摇匀 用微量移液器吸取601 8 加入到 J值为 06各种菌的培养基中 继续培养1DE5 观察菌 的生长速度和培养基的浑浊度 89 1菌耐酸碱试验 89 1菌的培养 将89 1菌在脱脂乳培 养基中活化一代 然后用 液体培养基培养二 代 将培养的菌液3 666 A 离心16 弃上清 液 菌体加入灭菌生理盐水3 666 A 离心16 后弃上清液 重复3次 最后加入灭菌生理盐水稀 释菌体 调培养基 J值 配制液体 培养基 用上述调 J值方法调培养基 J值分别为107 5017 306 20D D0I 耐酸碱的测定 吸取稀释好的89 1菌液 601 8加入到上述不同 J值的培养基中 以 J 值20D的培养液为对照组 培养2 后 摇匀培养 液 吸取601 8 加入到 J值20D的培养基中 继 续培养5 E5D 观察菌的生长速度和培养基的浑 浊度 C 1 C 5 CK 1菌的耐酸碱试验 C 1 C 5 CK 1菌的培养 将 C 1 C 5 CK 1菌在LB 固体斜面培养基上连续传3 代后备用 调培养基 J值 配制液体LB温箱中培养5 E D 观 察菌的生长情况和培养基的浑浊度 59菌在60 67 59菌在 固体斜面上传6代后 接种到 液体培养基 固体斜面培养基上 分别置 于60 67 0 8温箱中培养 随时观察生长情况 4359在67 8下的生长情况观察 将 4359菌在脱脂乳培养基传代9次 在液体 AB上 传代 次 然后用灭菌生理盐水洗6次后 用灭菌 生理盐水稀释后备用 用微量移液器吸取0 9 4 稀释后的菌液接种到液体 AB培养基中 分别置 于67 8温箱中培养 随时观察生长情况 B 59 B 5 C59在60 67 6D B固体斜面培养基上培 养 代 每一代在60 8温箱培养 B液体培养基和固体斜面培养基上 分别置于 60 67 6D 59 4359菌分 别用营养肉汤 液体培养基 AB液体培养基 菌在67 8温箱中培养6代后 6 000 F 离心90 G 弃上清液 其中4359菌用灭菌生理盐水洗6 次 方法同前 将各菌用灭菌生理盐水稀释为 H 901个 4的菌液 备用 4359菌培养 59菌耐胆盐试验 将345 59菌分别用营养琼脂斜面和 固体斜面于67 8温箱内培养6代后 分别接种到 加0 2 I 9 I I 液体培养基中 设不加胆盐的培养基为对 照组 放入67 8温箱培养 后 从加有胆盐的培 养液中各吸0 9 4 加到不加胆盐的营养肉汤和 液体培养基中 培养9 同时 将原来的 培养液继续培养9 然后观察生长情况 4359菌的耐胆盐试验 4359菌的培养和稀释同热稳定性试验 用微 量移液器吸取0 9 4稀释好的菌液加到配制好 的含有0 6 I 0 1 I 0 D I 9 I牛胆盐的液体 AB培养基中 同时设不加胆盐的液体 AB为 对照组 在67 8温箱中培养9 6 后 从中 吸取0 9 4加到不加牛胆盐的液体 AB培养基 中 继续培养9 59菌的药敏试验 4359 345 59菌的培养 处理同热稳定性 试验 用灭菌生理盐水将6种菌稀释成每毫升含 菌数为 H90 个的菌液 345 59菌的药敏试验 吸取0 4稀释好的菌液 分别加入营养琼 脂平板培养基和 平板培养基上 用灭菌推棒 涂抹均匀 再用镊子夹取药敏纸片放置于其上 每 个平皿等距离放 个药敏纸片 然后放入67 8温 箱培养9 观察有无抑菌圈 用游标卡尺测 量抑菌圈直径 并根据判断标准判定结果 4359菌的药敏试验 吸取9 4稀释好的菌液加入到灭菌平皿中 然后加入 0 4冷却到 2 8左右的 AB固体培 养基 摇匀 待冷却凝固后 用镊子夹取药敏纸片 放置于其上 每个平皿等距离放 个药敏纸片 然 后放入67 8温箱培养 59菌培养基确定 根据配方所配制的培养基 将 59在67 8 温箱中培养 59菌 单个菌株的急性毒性检验 除注射 C59菌液的试验组有 只小白鼠死 亡外 其余各试验组小白鼠没有死亡 也未见异常 表现J将小白鼠处死进行解剖 未发现病理变化 对 注射 C59菌液死亡的 只小白鼠进行解剖时 发现 只小白鼠的死亡是由于腹腔注射方法不正 确致使肠管破裂而引起的 对 C59菌按第9次 的方法进行重复试验 结果小白鼠没有死亡 也未 试验研究 值305 06 706 7006 1606的营养肉汤培养 后 再接种到 值 06的营养肉汤中 可以继续生长 说明该菌对酸 碱有一定的耐受力 而在 值107 506营养肉汤 培养 后 再接种到 值 06的营养肉汤时 则不能生长 88 1菌 分 别 在 值 06 706 7006 1606的营养肉汤培养 后 再接种到 值 06 的营养肉汤中 培养基变浑浊 可以继续生长 说 明该菌对酸碱有一定的耐受力 而接种到 值 107 506 305的营养肉汤培养 后 再接种到 值 06的营养肉汤时 则不能生长 9 1菌在 值5017的ABC液体培养基中 培养5 3 后 再接种到 值20 的ABC液体培 养基继续培养时 培养基变浑浊 说明在该培养基 中可生长 而在 值5017的ABC液体培养基中 培养2 后 再接种到 值20 的ABC液体培养 基继续培养时 在其中不能生长 在 值306 0 的ABC液体培养基中培养5 3 2 后 再接种到 值20 的ABC液体培养基继续培养时 在其中 均能生长 在 值107的ABC液体培养基中培 养5 3 2 后 再接种到 值20 的ABC液体培 养基继续培养时 在其中不能生长 以上说明9 1菌对酸碱具有一定的耐受力 CD 1菌 CD 5菌 DE 1菌3株菌在 值 306 0 的液体培养基中培养5 均可生长 而 在 值107的液体F8C培养基中培养5 则 不能生长 说明3株菌对酸碱具有一定的耐受力 在不同温度下各菌生长情况的观察 9 5菌在36 G和3 G下的生长速度没有差 别 该菌在76 G下也能生长 88 1菌在3 G生长 最快 在36 G可生长 但较慢 在 6 G也可生长 也较慢 9 1菌在3 G和 5 G下的生长情况没 有差别 CD 1菌 CD 5菌 DE 1菌3株菌在 G时CD 5菌和DE 1菌能缓慢 生长 而CD 1菌则不能生长 热稳定性试验 9 5菌对照组菌落数平均为56 个 试验组 在26 G恒温水浴箱作用56 后 菌落数平均为 1 6个 存活率为 H 88 1菌对照组菌落数平均 为1 个 试验组在26 G恒温水浴箱作用56 后 菌落数平均为2个 存活率为305 H 9 1菌 对照组菌落数平均为 26个 试验组在26 G恒温 水浴箱作用17 后 菌落数平均为2个 存活率 为60 H 试验表明 88 1菌和9 1菌的热稳定性差 9 5菌的热稳定性较好 对于88 1菌和9 1菌 在生产加工过程中 要避免高温的影响 株菌 对该类抗生素的耐药性是自然耐药 还是获得性耐 药 以及是否携带耐药质粒 有待于进一步研究 用于研制微生态制剂的益生菌首先必须是 安全的 即无致病性 不论从何种渠道筛选出的菌 株 在最终应用于生产实践之前 都必须经严格的 毒性试验 证明其安全无毒 毒性检验的试验表明 该研究选择的1株益生菌无致病性 是安全的 可将 该1株菌用于研制奶牛微生态制剂 参考文献 6 60 66 6 6 6 2A 陈天寿 微生物培养基的制造与应用 B 北京 中国 农业出版社 6 2 赵传芳 等 一株植物乳杆菌生长特性及生态效应的 研究 特产研究 6 A 丁轲 倪学勤 三株乳酸杆菌体外抑菌试验的研究 饲料工业 00