ELISA使用方法.ppt

免疫酶技术 基本原理 免疫标记技术 immunolabellingtechnique 是指用荧光素 放射性同位素 酶 发光剂或电子致密物质等作为示踪剂 标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应 特点 高度灵敏 特异 快速 定性 定量 定位分类 免疫荧光技术 放射免疫技术 免疫酶技术 免疫电镜技术 免疫胶体金技术和发光免疫测定 免疫酶技术 是利用酶标记抗体或抗原 以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术 实验一 ELISA方法检测人血清中IgG 酶联免疫吸附试验 enzymelinkedimmunosor bentassay ELISA 是一类常用的免疫酶技术 是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面 使抗原抗体反应在固相表面进行 常用的酶 辣根过氧化物酶底物为邻苯二胺 常用的方法 间接法 双抗体夹心法和抗原竞争法 双抗体夹心法 用于检测特异抗原 将已知抗体包被固相 加入待检标本 标本中含有相应抗原即与固相上的抗体结合 洗涤去除未结合成分 加入该抗原特异的酶标记抗体 加底物显色 目的 掌握ELISA技术 检测血清中IgG含量材料 抗人IgG抗体 羊抗人IgG抗体 一抗 已知IgG含量的参考蛋白 作标准系列 待检人血清辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体 二抗 包被液 PH9 60 05mol L碳酸盐缓冲液洗涤液 PH7 40 01mol LPBS底物溶液 OPD H2O2终止液 2mol LH2S04酶标反应板 一排 人 操作步骤 包被 用一抗包被 已做 洗涤3次 将洗液加入每孔 3min后倾去 加样 将已知含量的参考蛋白IgG倍比稀释7孔 第8孔加待检血清 第9孔加阴性血清第10孔作空白对照 100ul 孔 100ul稀释液 待测血清 PBS T20 100ul标准品 100ul 100ul 孵育 37 40min 洗涤3次加酶标记的抗人IgG抗体 即二抗 100ul 孔 孵育 37 40min 洗涤3次显色 加底物溶液 100ul 孔 室温避光15 30min 终止反应检测 490nm波长下检测 结果观察与分析 空白对照应无色 阳性孔呈棕黄色 标准系列各孔呈明显的颜色深浅梯度 绘制标准曲线 注意事项 做倍比稀释时 应从高浓度到低浓度 显色时一定避光 检测时应避免孔中有气泡 实验二 APAAP法检测淋巴细胞亚群 原理 用抗人T细胞CD的McAb与T细胞的反应 用羊抗鼠IgG搭桥 其中一个Fab段连接抗T的McAb 另一个Fab段连接APAAP复合物 再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断CD分子的存在 从而确定T细胞的各亚群 优点 不经化学交联反应 避免了抗体和酶活性降低 省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程 标本易于检测 保持时间长 应用 淋巴细胞分化抗原 活化抗原 MHC 类抗原表达的检测 APAAP法检测淋巴细胞亚群示意图 目的 T细胞亚群检测材料APAAP试剂盒 含CD3 CD4 CD8McAb TBS缓冲液Mayer苏木精复染液纯丙酮鼠抗人T亚群单克隆抗体 一抗 羊抗鼠IgG 二抗 操作步骤 1 分离PBMC PBS调整PBMC浓度 已做 2 甩片 固定 干燥 标记 已做 3 加一抗 鼠抗人 10ul 37 湿盒孵育 30min PBS洗3次 擦片4 加二抗 羊抗鼠 10ul 37 湿盒孵育 30min PBS洗3次 擦片5 APAAP复合物10ul 鼠抗AP 37 湿盒孵育 30min PBS洗3次 擦片6 碱性磷酸酶底物显色 37 湿盒孵育 30min PBS洗3次 擦片7 Mayer苏木精复染1min 自来水冲洗8 高倍镜下观察 结果观察 阳性细胞 细胞膜上或胞浆着色为红色阴性细胞 细胞膜上或胞浆着色为无色计数阳性细胞百分率 100 200个 正常值 CD2 CD3阳性细胞 60 80 CD4阳性细胞