生物技术制药7.doc

第一章绪论1.生物技术药物的分类：（1）应用重组DNA技术制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂；（2）基因药物：如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物、核酸酶；（3）来自动物/微生物的天然生物药物；（4）合成与部分合成的生物药物。2.生物技术制药的特点：（1）高技术：表现在其高知识层次的人才和高新技术手段；（2）高投入：主要应用于新产品的研究开发及医药厂房的建造和设备仪器的配置方面。（3）长周期：实验室研究阶段中试生产阶段，临床试验阶段（期），规模化生产阶段，市场商品化阶段及监督每个环节的严格复杂的药政审批程序等。（4）高风险（5）高收益。3生物技术药物的特性：分子结构复杂具有种属特异性治疗针对性强、疗效高稳定性差基因稳定性免疫原性体内的半衰期短受体效应多效性和网络性体验的特殊性第二章 基因工程制药1基因工程药物制药的主要程序：获得目的基因，组建重组质粒，构建工程菌（或细胞），培养工程菌，产物分离纯化，除菌过滤，半成品鉴定，成品鉴定，包装。2目的基因的获得：（1）逆（反）转录法：mRNA的纯化cDNA第一条链的合成cDNA第二条链的合成cDNA的克隆将重组体导入宿主细胞cDNA文库的鉴定目的cDNA克隆的分离和鉴定（有核酸探针杂交法和免疫反应鉴定法）（2）反转录聚合酶链式反应法：利用逆转录和聚合酶链式反应，该方法是在mRNA反转录形成cDNA第一链后，不再合成cDNA第二链，而是在特异性引物作用下，利用PCR法进行扩增，特异的合成目的cDNA链。（3）化学合成法：较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。3质粒的不稳定可分为：（1）分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不寒质粒子代菌的现象。常见分裂不稳定的两个因素：质粒丢失率与宿主菌、质粒的特性，培养条件有关。含质粒菌/宿主菌比生长速率差异的大小。一般宿主菌在非选择性培养基上具有生长优势。（2）结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、却是所致工程菌性能的改变。4提高质粒稳定性的方法：（1）选择合适的宿主菌：宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒稳定性。（2）选择合适的载体：低拷贝质粒工程菌产生不含质粒带菌频率高，如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性，高拷贝质粒工程菌产生不含质粒带菌频率低，但对稳定性不利。（3）选择压力：在培养基中加入选择性压力如抗生素，可以提高质粒稳定性，因为不含抗性质粒菌的生长就受到影响，在培养基中加入抗生素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。（4）分阶段控制培养：外源基因高效表达，重组质粒越不稳定，所以为了提高稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法，先使菌体生长至一定密度，外源基因表达处于阻遏状态，再诱导外源基因的表达。由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。（5）控制培养条件：培养条件对菌的比生长速率有很大影响，而基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性也有很大影响，提高比生长速率，能提高质粒的稳定性。调控环境参数如温度、ph、培养基组分和溶解氧浓度。有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。(6)固定化：基因重组E.coli固定化后，质粒稳定性和外源基因表达都有所提高5基因工程药物分离纯化的流程：发酵液细胞分离（胞内产物）细胞破碎固液分离包含体变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂产品技术要求：技术条件温和，保持活性选择性好，可达到较高纯度收率要高两个技术间能直接联系，不需要对物料加以处理纯化过程要快，满足高生产率的要求6基因表达之宿主菌选择要求：具有高浓度、高产量、高产率；能利用易得廉价原料；不致病，不产生内毒素；发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行重组cDNA技术；产物易提纯。常用的宿主菌有原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链霉素）和真核细胞（酵母和丝状真菌）7表达载体的特点：独立复制灵活的克隆位点和方便的筛选标记很强的启动子阻遏子很强的终止子所产生的mRNA具有翻译的起始信号第三章 动物细胞工程制药1动物细胞常用培养基分类:：天然培养基：天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，但是由于天然培养基制作过程复杂，批间差异大。因此逐渐为合成培养基所替代合成培养基：是人工设计，配置的培养基。今本组分：无机盐 氨基酸 维生素 碳水化合物 葡萄糖 指示剂酚红无血清培养基：即不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基，配方为基础培养基及添加组分两大部分，添加组分包括以下几大类物质：促贴壁物质 促生长因子及激素 酶抑制剂 结合蛋白和转运蛋白 微量元素2动物细胞大规模培养方法： 悬浮培养：细胞在反应器内游离悬浮生长的培养过程，主要对于非贴壁性一来性细胞 如杂交瘤细胞等。优点：操作简单 培养条件相对均一 传质和传氧较好 容易放大培养。缺点：细胞体积小 密度低。常用的反应器有通气式搅拌器和气升式生物反应器。 贴壁培养：细胞贴服于一定的固定支持表面上进行的培养方法。主要用于非淋巴组织和许多单倍体等贴壁依赖性细胞的培养。贴壁培养容器：转瓶 玻璃珠 微载体和中控纤维等。优点：容易更换培养液 灌注培养时 能达到高细胞密度 有利于产物的分泌表达 可改变培养液与细胞的比例。 缺点：操作较繁杂 检测受到一定限制 培养条件难以均一 传质和传氧差 放大培养是瓶颈。固定化培养：细胞包埋在微载体内或胶囊内 即细胞固定化后 进行悬浮培养 适宜于贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞的培养 细胞密度高 抗剪切力和污染等优点 是生产首选方法。有如下方法：a吸附：通过物理吸附使细胞贴附在固定载体表面 微载体和中控纤维培养等。b共价交联：双功能试剂处理细胞 使细胞之间交联的固定化方法。c包埋：细胞包埋在载体内部 网络型为高分子凝胶细网络 而为囊型为高分子半透膜 d微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊里第四章 抗体制药1基因工程抗体类型特点及其制备方法抗原抗体结合功能抗体可变区（V）同源性免疫源性抗体稳定区（C）类型基本结构相对分子质量人-鼠嵌合抗体人IgC-鼠IgV150 000改形抗体鼠CDRs替换人CDRs150 000Fab完整L链和Fd50 000FVVH和VL 25 000单链抗体VH-多肽-VL 27 000单域抗体VH或VL 12 500最小识别单位一个CDR 2 000人鼠嵌合抗体 在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H和I链的稳定区（C）基因连接成人鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。改性抗体 Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其他部分称框架区。用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。Fab 由完整的轻链和重链可变区+部分恒定区组成，大小为完整分子的2/3Fv 由VH与VL构成，由于其结合是非公价结合，故Fv不稳定。单链抗体ScFv 在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，即单链抗体。连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特 点。常用的连接肽是（GGGGS）3。单域抗体 即为VH或VL，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。最小的识别单位MRU 约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持抗体的特异性。2基因工程抗体的优点：最大程度降低抗体的鼠源性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反应。分子较小 穿透力强 更容易到达病灶的可信不为。可以根据治疗的需要 之辈多种用途的新型抗体。可以采用原核细胞、真核细胞或动植物等多种表达系统大量伸长，降低成本。3单链抗体的优点：可去除许多造成非特异反应的竞争性表面蛋白，肿瘤现象背景更加清晰；更易渗透肿瘤组织中，增加有效药物浓度；相对分子量越小，免疫源性越小，可消除人抗鼠的排异反应；在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因链接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。4单克隆抗体：是将抗体产生细胞与具有无限增值能力的骨髓瘤细胞相融合 通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的但克隆细胞系而产生的。针对单一的抗原决定簇 有事山单一的B淋巴细胞克隆产生的。不足：单克隆抗体均为鼠源性抗体 应用于人体可产生人抗鼠看题 加速了排斥反应 难以维持有效药物作用靶细胞时间。完整的抗体分子 分子量太大 难以透过实体肿瘤组织 打不到效果。所以需从两方面改造：降低免疫原性和降低分子量。5噬菌体抗体库的基本方法：获取目的基因抗体库技术的载体（多用噬菌粒）淘筛表达与鉴定6噬菌体抗体库技术的特点：模拟天然全套抗体库、避开了人工免疫和杂交瘤技术、可获得高亲和力的人源化抗体7基因工程抗体的表达：可在原核、真核细胞、转基因动植物中表达第五章 植物细胞工程制药影响植物次级代谢产物积累的因素1外供体选择 不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的积累时间各异。在生长曲线的不同时期，累积不同的产物。2培养条件的控制 (1)内在因素：接种和诱导培养基的组成：糖的作用、植物生长调节剂、氧气和酸度、渗出物碳源 植物生长调节剂 O2和pH 渗出物 (2)培养基环境的外部因素：温度搅拌频率培养容器的影响光的影响。第六章 酶工程制药1 固定化酶的特点（修饰酶）：具有生物催化剂的功能，和固相催化剂的功能。特点：可使用多次，稳定性高；反应后，酶底物、产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高；反应条件易控制。可连续化和自动化控制；酶的利用率高。单位酶催化的底物增加，用酶量减少；比水溶性酶更适合于多酶反应。2制备方法：载体结合法：将酶结合于不溶于水的载体上物理吸附法 优点：操作简单，固定和纯化同时进行，载体可再生。缺点：吸附量没有规律性，酶与载体之间结合力不强。离子结合法 酶通过离子键结合于载体上 优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活与回收率较高的固定化酶。 缺点：酶与载体之间结合力不强，易受pH、缓冲液的影响，在离子强度大的时候酶易从载体上脱落。共价结合法 酶通过共价键结合于载体上 优点：结合牢固 缺点：酶与载体结合条件复杂，反应条件剧烈，往往破坏酶的活性中心交联法 利用双功能或多功能试剂在酶分子间或载体间，或酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的方法包埋法 是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。选择性热变性法 专用于细胞固定化。是将细胞在适当的温度下处理使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性而使酶固定化于细胞内方法3固定化细胞的优点：无需进行酶的分离纯化细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高细胞内酶比固定化酶稳定性更高细胞内酶的辅因子可以自动再生细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应。局限性：利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在会形成不需要的副产物细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用载体形成的空隙大小影响高分子底物的通透性。4固定化酶的性质：酶活力下降，原因有空间构象变化影响活性中心的氨基酸；内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；空间位阻效应影响活性中心对底物的定性作用；包埋时酶被高分子物质透半透膜包围阻碍大分子透过膜与酶接近酶稳定性提高，主要体现在操作稳定性、贮藏稳定性、热稳定性和对蛋白酶的稳定性酶学特性的变化：底物专一性、最适pH、最适温度、米氏常数和最大反应速度第七章 青霉素1、所用菌种-产黄青霉菌 前体-苯乙酸、苯乙酰胺 发酵方法-补料分批发酵2、丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管（25，孢子培养，7天）斜面母瓶（25，孢子培养，7天）大米孢子（26，种子培养56h，1:1.5vvm）一级种子培养液（27，种子培养24h，1:1.5vvm）二级种子培养液（26-27，发酵，7天，1:0.95vvm）发酵液3、球状菌二级发酵工艺流程 冷冻管（25，包子培养，68天）亲米（25，包子培养，8-10天）生产米（28，包子培养，5660h,1:1.5vvm）种子培养液（26/25-24,发酵，7天，1:0.8vvm）发酵液4、工艺控制要点种子质量的控制 丝状菌的生产种子由冷冻安瓿瓶管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25培养7天，然后接种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素的一级种子罐内，26培养56h，菌丝浓度达6-8后，按10-15的接种量移入含有花生饼粉、葡萄糖的二级种子罐内，27培养24h，菌丝体积10-12，形态正常，效价在700D/ml左右便可做为发酵种子。 球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有0.5-1.0玉米浆的三角瓶培养原始米孢子，然后再移入罗氏瓶培养生产大米孢子（又称生产米），亲米和生产米均为25静置培养34天，形成绿色孢子即可收获。生产米的孢子量要求每粒米300万只以上。培养基成分控制碳源：产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前生产上普遍采用的是葡萄糖母液和工业用葡萄糖进行流加。氮源：生产上常用花生粉饼、玉米胚芽粉、麸皮及尿素。前体：可用苯乙酸、苯乙酰胺，一次加入量不大于0.1，并采用多次加入，以防止前体对青霉素的毒害。无机盐：加入的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等，用量要适度。另外，由于铁离子对青霉菌有毒害作用，必须严格控制铁离子的浓度，一般控制在30ugml。培养条件控制加糖控制：加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的PH值确定，一般在残糖降至0.6左右，PH值上升时开始加糖。补氮及加前体：补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素，使发酵液氨氮