细菌和霉菌总数的检验.doc

1 范围本标准规定了化妆品微生物学细菌和霉菌总数的检验。本标准适用于化妆品细菌和霉菌总数的检测。2 规范性引用文件GB 7916 化妆品卫生标准GB/T 7918 化妆品微生物标准检验方法 QB/T 1684-1993 化妆品检验规则3 一般规定细菌总数是指1g或1ml化妆品中所含的活菌数量。测定细菌总数和霉菌总数可用来判明化妆品被微生物污染的程度，以及生产所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。3.1方法提要：本标准采用标准平板计数法。化妆品中污染的微生物种类不同，每种微生物都有它一定的生理物理特性，培养时对营养要求、培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。在实际工作中，不可能做到满足所有菌种的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使用的条件下（在卵磷脂、吐温-80营养琼脂上，于37培养48h；在虎红琼脂培养基上培养72h)生长的一群嗜中温的需氧及兼性厌氧的微生物总数。3.2仪器3.2.1250ml锥形瓶。3.2.2电子天平、量筒。3.2.3压力蒸汽灭菌锅。3.2.4移液管。3.2.5灭菌培养皿：直径9cm。3.2.6酒精灯。3.2.7 恒温培养箱。3.2.8放大镜。3.3培养基和试剂的制备3.3.1生理盐水： 氯化钠8.5g 蒸馏水1000ml溶解后，分装到加适量玻璃珠的250ml锥形瓶内，每瓶90ml，经121(0.11MPa)20min高温高压灭菌。3.3.2卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基：制法：称取51g粉状卵磷脂、吐温80-营养琼脂成品培养基加入到1000ml纯水中混合,溶解均匀后分装,经121(0.11MPa) 20min高温高压灭菌，储存于冷暗处备用。3.3.3虎红琼脂培养基：制法：称取31.6g粉状虎红琼脂成品培养基加入到1000ml纯水中混合,溶解均匀后分装,经121(0.11MPa) 20min高温高压灭菌，储存于冷暗处备用。4 倒培养皿操作步骤：4.1 按国家标准要求检测细菌总数和霉菌总数. 倒培养皿前供检样品的采集、保存和样品制备按微生物检验总则要求进行操作。4.1.1 细菌总数检测：用移液管吸取1：10稀释的检样1ml，注入到一个灭菌培养皿内；将熔化并冷至4550的卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基倾注于培养皿内，每皿约15ml；随即水平转动培养皿，使样品与培养基充分混合均匀，待培养基凝固后，翻转培养皿，置37培养箱内培养48h。4.1.2 霉菌总数检测： 用移液管吸取1:10稀释的检样1ml，注入到一个灭菌培养皿内；将熔化并冷至4550的虎红琼脂培养基倾注于培养皿内，每皿约15ml；随即水平转动培养皿，使样品与培养基充分混合均匀，待培养基凝固后，翻转培养皿，置25培养箱内培养72h。5 菌落计数方法： 先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大510倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各培养皿的菌落数后，求出同一稀释度各培养皿生长的平均菌落数；若培养皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该培养皿不宜计数；若片状菌落不到培养皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个培养皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。6菌落计数原则及报告方法：6.1首先选取平均菌落数在30300之间的培养皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释 度的平均菌落数符合此范围时，即以该培养皿菌落数乘其稀释倍数（见表中例）6.2若有两个稀释度，其平均菌落数均在30300个之间，则应求出两者菌落总数之比值来决定。 若其比值小于或等于2应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的菌落数(见表中例2例3)。6.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例4)。6.4若所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例5)。6.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例6)。6.6若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升小于10个。6.7菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示(见下表报告方式栏)。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。细菌计数结果及报告方法：例次不同稀释度的平均菌落数10-1 10-2 10-3两稀释度菌数之比菌落总数个/g或个/ml报告方式个/g或个/ml11365 164 201640016000或1.610422760 296 461.63800038000或3.810432890 271 602.22710027000或2.71044不可计 4650 513-513000510000或5.1105527 11 5-270270或2.71026不可计 305 12-3050031000或3.11047 注解：7.1 操作注意事项：1） 尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。2） 制成供试液后，应尽快稀释，注皿。一般稀释后应在1小时内操作完毕。3） 注意抑菌现象，由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少，而高释释度时菌落数反而增大。4） 对照试验。化妆品的稀释液（特别是1:1O的稀释液）常带有化妆品颗粒，有时与菌落很难区分，为了避免与细菌菌落发生混淆，可作一个检样稀释液与琼脂混合的平板，不经培养放到4环境中，以便计数检样菌落时用作对照。5） 另一种防止化妆品颗粒与菌落混淆的方法是培养基中加TTC。注：TTC溶液要放冷暗处保存，以防受热与光照而发生分解。TTC溶液在使用前应在水浴中煮沸半小时。7.3 菌落计数及报告注意事项1）如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，有两种可能性：一是检验工 作中发生差错；二是受防腐剂影响。这二种情况均不可用作检样计数报告的依据。2）如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细胞 块被分散所造成。一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链应作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。此外，如培养皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落，也不应分开来数。3）如果所有平板上都菌落密布，不要用多不可计报告，而应在稀释最大的平板上，任意数其中两个平方厘米中的菌落数，除以2求出lcm2内平均菌落数，乘以皿底面积63.6cm2，再乘以其稀释倍数。以此结果作报告，例如：10-110-3 稀释度的所有平板上均菌落密布，而在10-3稀释度的平板上任意数两个平方厘米内的菌落数是60个，皿底直径为9cm，则该检样每克（或ml）中“估计”菌落数为：60263.610001.9106 63.6是按皿底直径为9cm时计算而得的面积，如所用培养皿底直径不是9