高级生化考题(小字).doc

名词解释 蛋白质部分1. 盐溶：低浓度的中性盐可以增加球状蛋白的溶解度，此现象称为盐溶。2. 盐析：当盐浓度增高时，如半饱和或饱和状态，蛋白质溶解度降低，从水溶液中沉淀出来。此现象称为盐析。3. 透析：利用蛋白质大分子不能透过半透膜，而小分子杂质如无机盐、单糖等能透过半透膜的性质，使蛋白质与小分子杂质分开。4. 超过滤：利用压力，强行使水和其他小分子杂质透过半透膜，而蛋白质被截留在膜上以达到分离目的的方法，对蛋白质溶液有分级作用，且有浓缩和除盐作用，可分离不同分子量的蛋白质。5.高效液相层析：6. 电泳：指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。7.亲和层析：利用生物大分子物质能与相应的配基专一可逆结合的性质，如蛋白质分子能对配基专一性地结合或复合物，改变条件不能解离，利用这种特性而设计的一种层析技术。8. 离子交换层析：是一种用离子交换脂作为介质，即离子交换剂的层析法。9.蛋白质一级结构：指多肽链上各种氨基酸的排列顺序，即氨基酸残基序列。10.二面角：由C2-N, 单键旋转和C22-C2单键旋转角度决定的相邻二个肽平面在空间上的相对位置的夹角。 11.二级结构：由多肽链主链骨架折叠产生的由H键等次级键系得构象单元或局部空间结构。 主要是肽键本身的盘旋方式而不涉及侧链的构象及其它链的关系。 12.超二级结构：由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构体。 13.结构域：对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽键在超二级结构的基础上组装或二个或俩个以上的相对独立的三维实体，再缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体既结构域。14.贝塔转角：由四个连续的AA残基组成，由第一个AA的C=0与第四个AA的H-N形成H键，两个Ca原子之间的距离小于0.5nm.15.伽玛转角：伽玛转角由多肽链上3个连续的AA残基组成，主链骨架以180度返回折叠，第一个残基的C=0与第三个残基上的N-H形成氢键。16.欧米格环：由不超过16个残基组成的肽段，环的首尾两个残基间的距离小于0.1 nm ，以亲水残基为主，故总位于蛋白质分子表面，该环与生物活性有关。 17.DNS-CL-EDMAN 法：是将高灵敏度的DNS技术与能连续降解的Edman反应有机结合起来的一种测定氨基酸排列顺序的方法。18.Bohr效应：血红蛋白与氧气的结合，受PH及二氧化碳浓度的影响，在周围组织低PH及高二氧化碳的情况下，血红蛋白与氧气的亲和力下降，反之在肺部微血管中，二氧化碳被释放，氢离子浓度下降，PH值升高，血红蛋白与氧气的亲和力下降，这种PH与二氧化碳浓度对血红蛋白与氧气的结合及释放的效应称为Bohr效应。1、 简述考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理及该法的主要优缺点？答：考马斯亮G-250在游离状态下是棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后，呈现蓝色，前者的最大吸收在465nm，后者在595nm，在一定的范围内，吸收度与蛋白质含量成正比。可用于蛋白质的定量测定。该法反应十分迅速，仅2分钟左右蛋白质与考马斯亮G-250即可达到稳定结合，反映比较灵敏，重复性也好，但tris,EDTA,尿素等对测定有一定的干扰。2、 根据分子大小不同分离纯化蛋白质的方法有哪些？举出三种方法简述其原理？答：透析，超过滤，密度梯度区带离心，凝胶过滤，高效液相层析。透析：利用蛋白质大分子不能透过半透膜，而小分子杂质如无机盐、单糖等能透过半透膜的性质，使蛋白质与小分子杂质分开。超过滤：利用压力，强行使水和其他小分子杂质透过半透膜，而蛋白质被截留在膜上以达到分离目的的方法，对蛋白质溶液有分级作用，且有浓缩和除盐作用，可分离不同分子量的蛋白质。凝胶过滤法：当大小不同的蛋白质分子混合物流经凝胶层析柱时，必凝胶珠网孔达的蛋白质分子不能进入珠内网孔结构，而被排除在凝胶珠外，随着缓冲液在凝胶珠之间的空隙向下移动，并最先流出柱外，比网孔小的蛋白质分子能够不同程度地进出凝胶珠网孔内外，从而这些大小不同的蛋白质所经的路径不同，随着缓冲液向下移动，较大的蛋白质分子移动路程较短，先下来。较小的后下来。3、 根据溶解度差异分离纯化蛋白质的方法有哪些？举出三种方法简述其原理？答：盐溶，盐析，有机溶剂法，蛋白质沉淀剂法，等电沉淀法。盐溶：低浓度的中性盐可以增加球状蛋白的溶解度，此现象称为盐溶。主要是由于蛋白质分子吸附某种盐离子后代电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。盐析：当盐浓度增高时，如半饱和或饱和状态，蛋白质溶解度降低，从水溶液中沉淀出来。此现象称为盐析。主要是由于大量中性盐的加入，盐离子与水这种偶极分子作用，使水分子的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化物，导致蛋白质的水和程度减少，从而驱使蛋白质的溶解度降低。蛋白质沉淀剂法：向无细胞抽提液加入沉淀剂，如醋酸铝，丹宁酸或离子型表面活性剂等，可以使一些杂蛋白或粘多糖发生沉淀，沉淀物可以用离心分离除去。4、 根据电荷的差异分离纯化蛋白质的方法有哪些？简述其原理？答：电泳，离子交换层析。电泳：指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。由于蛋白质具有两电性质，当蛋白质溶液PH大于等电点时，该蛋白质溶液带负电荷，在电场中向正极移动，反之则带正电荷，在电场中向负极移动。不同的带电颗粒在同一电场中的速度不同，故可分离出不同的蛋白质。离子交换层析：是一种用离子交换脂作为介质，即离子交换剂的层析法。阳离子交换树脂含有酸性基团，可以解离出H，当溶液中含有其他阳离子时，他们可以交换而结合在树脂上。阴离子交换树脂含有碱性基团，可以解离出OH，当溶液中含有其他阴离子时，他们可以交换而结合在树脂上。由于蛋白质有两性性质，当蛋白质溶液PH大于等电点时，该蛋白带负电，可结合于阴离子交换剂上，当蛋白质溶液PH小于等电点时，该蛋白带正电，可结合于阳离子交换剂上，即使带同电荷的蛋白质分子，由于所带的电荷不同，与离子交换剂的亲和能力也不同，利用这种出差异可分离蛋白质。5、 测定蛋白质分子量的方法有哪些？举出三种方法简述其原理？答：凝胶过滤法，凝胶薄板层析法，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法，聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法，渗透压法，超离心沉降速度法，沉降平衡法，毛细管电泳法。凝胶过滤法：当大小不同的蛋白质分子混合物流经凝胶层析柱时，必凝胶珠网孔达的蛋白质分子不能进入珠内网孔结构，而被排除在凝胶珠外，随着缓冲液在凝胶珠之间的空隙向下移动，并最先流出柱外，比网孔小的蛋白质分子能够不同程度地进出凝胶珠网孔内外，从而这些大小不同的蛋白质所经的路径不同，随着缓冲液向下移动，较大的蛋白质分子移动路程较短，先下来。较小的后下来。后根据公式算出。凝胶薄板层析法：薄板层析即在玻璃上涂上一层支持剂作固定相，用缓冲液作流动相，根据样品中各组分与固定相亲和力的不同使物质得到分离的装置。当流动相溶液沿薄板点有样品的一端向另一端流动时，全排组的大分子物质在板上迁移的速度最快，小分子速度最慢。在同一块板上，可以用一系列不同分子量的标准蛋白质和未知蛋白质同时层析，后可用滤纸复印，用适当方法染色，显示出层析位置。在一定有效分离范围内，球形蛋白质的相对迁移距离与分子量的对数作图是一条直线，有未知蛋白质的相对位移可求出分子量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：在含有琉基乙醇的SDS溶液中煮沸蛋白质，SDS结合到蛋白质分子上，并使组成蛋白质分子的各条链分开，SDS复合物的特性能使其在凝胶电泳中的迁移不受蛋白质原有的电荷的影响，迁移率成为复合物长度的函数，而长度又与分子量成正比，所以其关系是6、 高效液相色谱仪是依据什么原理设计出来的？它有哪些优点？答：采用大幅降低支持物的颗粒度，同时增加压力，以维持必要的流速而设计的层析方法。利用混合中各组分理化性质的差别，使各组分以不同程度分布在固相和流动相中，流动相推动样品中各组分经固定相向前迁移使各组分迁移速度不同，而对物质进行分离的方法。优点：分离效率高，应用范围广，分析速度快，样品用量少，易于自动化等。7、 以磺酸型阳离子交换柱为例，简述从混合氨基酸中分离各种氨基酸的原理？答：离子交换树脂是人工合成的，具有酸性基团或碱性基团，并具有网状结构的高聚物。（1） 先用PH3.25的柠檬酸钠缓冲液来平衡树脂。即将其处理成钠型。（2） 将氨基酸混合液调PH值至2.2，即小于等电点，在低PH离子强度下，由于缓冲液H离子浓度大，H离子解离被抑制，使氨基酸带正电荷。（3） 灌注：由于静电引力，带正电荷的氨基酸被树脂吸附，与树脂上的钠离子发生交换，将钠离子交换下来。（4） 洗脱：用PH逐渐增高的缓冲液洗脱。分离出游离氨基酸。8、简述蛋白质一级结构测定的基本步骤？ 答：（1）分离提纯待分析的蛋白质样品。（2）测定蛋白质的分子量（3）测定蛋白质分子中多肽链数目。（4）拆分蛋白质分子中的多肽链。（5）对每条肽链进行氨基酸组成分析。 （6）鉴定多肽链的N-末端或C-末端残基。（7）多肽链部分裂解及肽片断的分离。（8）测定各肽段的氨基酸顺序。（9）建立完整多肽的氨基酸顺序。（10）确定二硫键的位置。9、蛋白质N-端分析的方法有哪些？举出三种方法简述其原理答：2，4-二硝基氟苯法（DNP法），二甲氨基萘磺酰氯法（DNS法），Edman 降解法，DABIT/PITC双偶合法，氨肽酶法。10、测定蛋白质肽段氨基酸排列顺序的方法有哪些？举出两种方法简述其原理？答：减数Edman 降解法，DNSCLEdman法，酶法，蛋白质自动顺序分析仪法。DNSCLEdman法：该法是将高灵敏度的DNS技术与能降解的Edman反应有机地结合起来的一种测序方法。将样品用水溶解后，取少量样品用DNSCL法测氨基酸N端的氨基酸，在一定条件下反应后，抽取N端形成的PHT氨基酸弃去，此时第二个氨基酸变为N末端，将上述抽取后的肽段，再以DNS法测定N端氨基酸，剩下的溶液再按Edman法将此N端氨基酸脱除 ，反复测定。11、简述蛋白质含量（浓度）测定的方法？ 1、凯氏定氮法：每一种蛋白质都有其恒定的含氮量， 根据含氮量可计算蛋白质的含量。降一定的蛋白质用浓硫酸消化分解，使有机氮全部转化为硫酸氨，再与NAOH生成氢氧化铵，加热后得到的氨气被吸收于标准盐酸中，用反滴定法滴定剩余的酸。或用硼酸吸收，吸收氨气后，氢离子浓度降低，再用盐酸滴定，使硼酸恢复到原来的氢离子浓度，所用的盐酸即氨气的MOL数，求得蛋白质中含氮量， 再换算为蛋白质的含量。 2、双缩脲法：双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用生成紫红色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质的肽键也能与铜离子结合，产生的红色络合物在540nm波长处有最大吸收，且颜色与蛋白质的含量成正比，而与蛋白质分子量和氨基酸组成无关，可以进行定量测定。该法常用于0.510mg/ml蛋白质浓度的测定。 3、福林酚试剂法：第一步即双缩脲反应，第二步是生成的蛋白质CU+络合物，用磷钼酸磷钨酸试剂还原，生成深蓝色的产物，其颜色深浅与蛋白质的含量成正比。定量范围：0.020.5mg/ml。4、考马斯亮G-250在游离状态下是棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后，呈现蓝色，前者的最大吸收在465nm，后者在595nm，在一定的范围内，吸收度与蛋白质含量成正比。可用于蛋白质的定量测定。5、紫外吸收法：大多数蛋白质在275280nm处有一吸收高峰， 在一定范围内，蛋白质溶液在280nm的光吸收值与其浓度成正比。测定范围：0.11mg/ml。12、简述血红蛋白的结构特点及其氧和特点？ 答：血红蛋白是一种球状的色素蛋白，分子量66700，由珠蛋白和血红素结合。血红蛋白由四个亚基组成（a2b2），每个亚基含一条多肽链和一个血红素辅基。所以血红蛋分子上有四个O2的结合部位。血红蛋白的四个亚基按四面体排布，亚基间凹凸互补。在其四级结构中，两个a亚基之间或两个b亚基间的接触点很少，但在a1b1和a2b2之间的接触点很多，很大部分由氨基酸残基的疏水侧链组成，在4条多肽链之间有一个中央空隙。 氧和特点： 1、O2与血红蛋白结合后，能促使更多的02与同一血红蛋白分子结合。2、血红蛋白对O2的亲和性有赖于PH值和co2的影响。3、血红蛋白对O2的亲和性还进一步受像2，3二磷酸苷油酸这样的有机磷酸化合物影响，更有利于血红蛋白在组织中释放O2。13、H+，CO2，BPG对血红蛋白结合氧的影响？ 答：血红蛋白与氧气的结合，受PH及二氧化碳浓度的影响，在周围组织低PH及高二氧化碳的情况下，血红蛋白与氧气的亲和力下降，反之在肺部微血管中，二氧化碳被释放，氢离子浓度下降，PH值升高，血红蛋白与氧气的亲和力下降。BPG浓度增高血红蛋白与氧气的亲和力下降，反之亲和力增高。核 酸 笔 记1、卫星DNA：主要分布在染色体的着丝粒部位，由非常短的串联重复DNA序列组成。因其具低复杂性，又称简单序列DNA，又因为其不同寻常的核苷酸组成，经常在浮力密度梯度离心中从整个基因组DNA中分离成一个或多个“卫星”条带，故称为卫星DNA。2、小卫星DNA：一般位于端粒处，是由高度重复序列组成的小基因簇。两种形式：1.真核生物的端粒DNA，由几千个碱基的特性的五核苷酸或六核苷酸串联重复形成，2.高度可变的小卫星DNA，位于亚端粒区域在不同的个体和基因的不同位点上。3、VNTRs序列：同向重复序列可变数，不仅用于基因范围的遗传作用，还广泛用于DNA印迹的诊断标记。4、DNA指纹：在人类VNTRs位点15kb，但人的总DNA提取后用限制性内切酶切成不同的片断，然后以VNTRs中的特异序列为探针进行southerm杂交，可发现阳性片断的大小各不相同。由于不同个体的这种串联重复的数目和位置各不相同，所以VNTRs的southerm杂交带谱就具有高度的个体特异性，称DNA指纹。5、卫星DNA：重复单位序列最短，具高度多态性，在遗传上高度保守，是理想的遗传标志。卫星RNA：是指一些必须依赖于辅助病毒的才能复制的小分子单链RNA片段，它被包装在辅助病毒的包体中。6、信息沟：大沟，小沟，特别是大沟，对于在遗传上有重要功能的蛋白质识别DNA双螺旋结构上的特定信息是非常重要的，只有在沟内pr才能识别。7、H-DNA：含有镜像重复的多聚py/多聚pu序列的DNA可通过hoogsteen 碱基配对形成的分子内三链结构。8、变性：在加热或极端ph条件下，核酸的黏度会突然消失，实质是配对的碱基间的氢键断裂和相邻碱基间的碱基堆积力消失。变性因素：1.热力2.强碱3.强酸（甲酸等）4.有机溶剂5.变性剂（尿素，甲酰胺等）6.射线7.机械力9、TM溶解温度：DNA热变性发生在一个很窄的温度范围内，通常把热变性过程中光吸收达最大吸收一半时的温度称TM。TM值的影响因素：1.核酸的均一程度，均一性越高的样品变性过程的温度范围越小2.TM值与GC含量成正比3.与介质离子强度成正比。10、复性：变性DNA在一定条件下又可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构。复性条件：1.有足够的盐浓度消除静电斥力，常用盐浓度0.150.50mol/l的Nacl；2.有足够的温度破坏无规则的氢键，一般比TM低2025度。复性的影响因素：1.DNA片断的大小2. DNA的浓度3. DNA重复性4. 温度5.盐浓度复性的检测：1.减色效应,紫外光吸收减少30% 2. 羟基磷灰石柱层析，对双链DNA吸附力较强，不易吸附单链。11、核酸的非酶促转化：核酸作为遗传信息的载体部分是因为它遗传上的稳定性，它并非一成不变的，即使在生理条件下，在无酶催化下，也发生很慢的化学转化，1.脱氨基作用2.N-B-糖苷键的水解作用3. DNA链的呼吸作用12、核酸的酶促反应：1.DNA的甲基化：甲基化通常限定在DNA分子的特定序列区域，A，C碱基频率要比G，T要高。将甲基加入DNA中的酶称为DNA甲基转移酶或甲基化酶，都利用S-腺苷酰甲硫氨酸作为甲基供体。13、Hoogsteen配对：已配对的碱基上存在着潜在的氢原子供体与受体，能进一步形成氢键特别是大沟中一些功能基团的重排。14、超螺旋：如果DNA分子额外的多转几圈或少转几圈，都会使DNA中存在张力，此张力会使分子发生扭曲，这种扭曲态为超螺旋。15、三链DNA：单链DNA与双链分子中的碱基互相作用，通过双链DNA的大沟，第三条链与双链中的一条链的碱基形成非WAHEN-CRICK配对，而是形成loosteen碱基配对形成的三链。16、DNA双螺旋的呼吸作用：DNA双螺旋结构中的H键处于不断的裂解和复合的热平衡状态，这种H键的快速断裂和再生过程成为DNA的呼吸作用。17、分子杂交：不同来源的DNA分子放在一起热变性，然后慢慢冷却，让其复性，若这些异源DNA之间有互补或部分互补序列，则复性时会形成“杂交分子”，DNA与互补的RNA之间也可以发生杂交。18、稳定双螺旋结构的力：1.碱基堆积力，电子云交错而形成的一种力，最主要的力；2.氢键，互补碱基间可形成氢键；3.离子键，对维持DNA的空间结构起作用。4.碱基分子内能19、减色及增色效应：20、回文结构：又称反向重复序列，是一段能够自我互补的序列，能形成发夹结构或十字形结构。不配对的地方形成凸环。21、镜像重复序列：在同一条DNA链上没有互补序列，不能形成发夹结构和十字形结构。能形成HDNA。22、拓扑异构酶：可以改变DNA拓扑异构体的L值，使双链超螺旋DNA转变成松弛型环状DNA或使松弛型环状DNA变成负超螺旋DNA的一种蛋白质。23、基因文库：是一群细菌克隆，每个克隆含有一个带有某一供体生物不同DNA片段的质粒或噬菌体载体；这群克隆有95-99的可能性使基因组DNA的每一片段至少存在于一个克隆中。24、4.416螺旋（螺旋）：每转一圈需要4.4个氨基酸残基，残基高度为0.12nm，螺旋半径为0.3nm，n=4.不稳定.25、a-螺旋（3.613螺旋）：是非整数螺旋，每转一圈需要3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm，=-55 =-45，由相邻螺旋间形成链内氢键，由氢键所封闭成13环。26、r-螺旋（310）：每转一圈需要3个氨基酸残基，靠氢键所形成的环由10个原子组成，为r-螺旋（310），=-49=-26,残基高度为0.2nm，螺距为0.6nm，螺旋半径为0.2nm。27、卫星病毒：能编码自身蛋白，因此由它介导感染，而在感染周期中必须利用辅助病毒的复制酶才能进行复制和增殖，与此同时也干扰了辅助病毒的复制，卫星病毒的基因组与辅助病毒的基因组没有同源性，抗原性也不同。28、CDNA文库：是由细胞全部MRNA反转录生成的CDNA克隆的总合。29、载体：将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具称为载体。30、穿梭载体：通常是指那些既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。31、转化：细菌或细胞吸收质粒DNA的过程。32、转染：细菌或细胞吸收噬菌体DNA的过程。33、转导：DNA通过正常的噬菌体感染途径进入细胞的过程。34、southern印迹法：将凝胶上分离的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上，再通过同位素标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段的方法。基本步骤：1、限制性酶切DNA分子2、琼脂糖凝胶电泳分离3、碱变性4、转膜5、探针杂交6、洗膜除去未杂交的探针7、放射性自显影。35、nouthern印迹法：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素过滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，然后再进行核酸杂交的一种实验方。36、wouthern印迹法：将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素过滤膜上，然后与放射性同位素I125标记的特定蛋白质的抗体进行反应。37、基因工程：是指在体外将核酸分子插入病毒，质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参与原先没有这类分子的寄主细胞， 并能持续稳定地繁殖。一、DNA的多态性及产生多态性的原因：脱氧核糖和磷酸组成的骨架上的许多键都可以转动，随热力学的变化，可使链弯曲，伸展或碱基分开。这就使具有同样碱基配对的DNA双螺旋可以采取另一些构象，DNA构象上这种差异称为多态性。原因：（1）脱氧核糖的五元环能折叠成各种构象 （2）组成磷酸脱氧核糖骨架的连续键可以转动 （3）C1N糖苷键可以自由转动。二、特殊序列及特殊结构的意义：（1）是DNA结合蛋白的识别位点 （2）与基因信息表达调控有关 （3）通过特殊序列调控细胞代谢的方法，在医药和农业上具有潜在的应用价值，正成为具有商业开发价值的领域。三、真核生物基因组与与和原核生物基因组的区别：1 真核基因组的长度比原核的大2 真核基因组中有内含子 经过翻译后被剪切而原核中没有内含子 3 真核基因表达调空正性调节为主要 原核生物负调节为主 4 有的原核基因组可以整合到真核基因中 例如逆转录病毒基因 5 原核生物的细胞中除了主染色体以外，还含有各种质粒和转座因子。真核生物除了核染色体以外，还存在细胞器DNA，如线粒体和叶绿体的DNA，为双链环状，可自主复制。6 原核生物的DNA位于细胞的中央，称为类核（nucleoid）。真核生物有细胞核，DNA序列压缩为染色体存在于细胞核中。7 真核基因组都是由DNA序列组成，原核基因组还有可能由RNA组成，如RNA病毒。四、简述核酸DNA测序的主要方法及原理方法？1、Sanger酶法-双脱氧链末端终止法：利用噬菌体r13在生活周期上的特点，使用DNA重组技术，建立了通用模板和通用引物的快速检测方法。原理及方法：、分别进行4组反应，每组反应中含有4dNTP及其中的一种ddNTP。、通过控制反应系统中dNTP与ddNTP的比例，可以是双脱氧核苷酸随机的参入互补链并在不同的位置上终止合成反应。最后得到一组长短不同，而3“末端均以双脱氧核苷酸结尾的DNA片段。4组反应就得到4套片段，而5端一律从引物开始有相同起点带放射性标记。、在高分辨率的聚丙酰变性凝胶上电泳分离，可以按片段从小到大的顺序读出氨基酸顺序。 2、MaxamGilbert化学法：在对末端标记的DNA进行碱基特异性切割反应后进行凝胶分离的方法。此方法不需要酶，对单链和双链DNA都适用，不受DNA二级结构的干扰。适用于微克隆过的基因组DNA的测序。原理及方法：放射性标记末端 、碱基特异性切割 、聚丙酰变性凝胶上电泳分离，对测序凝胶的4个泳道进行分析就可以确定出序列。特定的碱基修饰反应。3、杂交测序法与芯片技术：利用一组已知序列的寡聚核苷酸端序列作为探针，同某一特定的较长的靶DNA分子杂交，从而测定其核苷酸序列。原理及方法：把靶DNA分子同一组已知核苷酸顺序的寡核苷酸探针杂交。、然后对那些能够同靶DNA形成完全上连体分子的寡核苷酸探针之间的碱基重叠关系作比较分析，并据此推出靶DNA的核苷酸顺序。4、PCR测序5、单核苷酸测序法五、理想载体的条件？ 1、具有自主复制能力2、分子量小，便于与DNA体外合作。3、含有多种限制性内切酶的单一识别序列。4、携带易于筛选的选择性标记，常用抗药性，营养缺陷型和形成噬菌体的能力等作为选择标记。5、使用安全。六、简述RNA的功能？ 1、控制蛋白质的合成2、作用于RNA转录后加工修饰3、基因表达及细胞功能的调节4、生物催化及其他细胞功能5、遗传信息的加工与进化6、染色体、核糖体、核酶等骨架构成的成分7、信号识别与传导。七、RNA世界（RNA的多样性）？ 1、mRNA:编码蛋白质的转录产物，携带翻译信息。 2、tRNA：翻译过程中的适配器，将mRNA的三联体密码子翻译成蛋白质的序列，在反转录病毒中tRNA可作为DNA的引物。 3、rRNA:核糖体的骨架构成，翻译机制的中心，催化肽链的形成。 4、hnRNA：mRNA剪接前体，真核生物基因转录产物经加工形成大小不等的中间产物。 5、snRNA：核质中低分子量的RNA，参与mRNA、tRNA、rRNA前体的加工，协调胞内物质运输，参与分泌蛋白的运输，代谢稳定进化上保守，有些5端有帽子结构与蛋白质连在一起以核糖核蛋白RNP形式存在。 6、siRNA：RNA干涉现象中，中介入细胞中特定双链RNA加工裂解成的21-23nt的正义和反义链组成等干扰基因表达的小分子RNA，其引发的RNAi是转录后基因沉默现象的机制之一。 7、micRNA(反义RNA)：与mRNA互补，可与其形成双螺旋结构阻断蛋白质的合成，在翻译水平上调节G的表达。 8、ribozyme: 具有高效特异催化功能的RNA。 9、脱氧核酶（dexy ribozyme）:具有催化活性的单链RNA分子，具有ASODN的反义抑制作用和核酶的靶向性剪切活性，稳定性好。 10、ASODN（反义寡聚脱氧核糖核酸）：人工合成的，与靶mRNA配对互补，以激活Rnaseh来降解RNA/DNA杂交分子中的靶RNA，阻断RNA的加工、翻译、抑制G的表达。 11、iRNA：在DNA复制过程中作为后滞链合成引物的短RNA片段。 12、端粒RNA：端粒酶的组成部分，可作为形成端粒重复序列的模版。 13、snoRNA(核仁小RNA)：核仁中RNA加工与碱基修饰所必需的。 14、scRNA（胞质内小RNA）：在胞质中发现的多种功能的低分子量RNA。八、基因文库与CDNA文库的建立？基因文库的建立：1、染色体DNA的片断化2、载体DNA的制备3、体外联结与包装4、重组噬菌体感染E.coli 5、基因组文库的鉴定与增CDNA文库的建立：1、制备mRNA 2、合成cDNA 3、制备载体DNA 4、双链cDNA的分子克隆5、对构建的cDNA文库进行鉴定与扩增。1、Ribozyme：具有高效特异催化功能的RNA。2、抗体酶：用酶反应中间物作为抗原而诱导产生的具有对中间物催化能力的抗体称为抗体酶。3、探针酶：既保持高度反应性，又能在DNA中任意选定区域内进行切割的酶。4、人工酶：人工合成的具有催化活性的蛋白质或多肽。5、模拟酶：利用在有机化学合成的一些比酶结构更加简单的具有催化功能的蛋白质分子。6、克隆酶：用基因工程技术大量生产的酶。7、突变酶：用基因定位突变技术修饰天然酶基因，然后用基因工程技术生产该突变基因的酶，被称为突变酶。8、单纯酶：从化学组成来看，除了蛋白质外不含有其它蛋白质的酶。 9、单体酶：只含有一条多肽链的酶。10、结合酶：从化学组成来看，除蛋白质外还含有其它物质的酶，一般为一些对热稳定的非蛋白质小分子物质或金属离子。11、寡聚酶：由两个或两个以上的亚基组成的酶，这些亚基可以是相同的也可以是不同的。12、多酶复体：几种酶靠共价键彼此嵌合而成，其催化的反应依次连接，有助于一系列反应的进行。13、固定化酶：将水溶性的酶用物理或化学的方法处理，使之成为不溶于水的但仍具有酶的状态而得到的酶。14、同工酶(isozyme)：催化相同的反应，但蛋白质分子结构，理化性质免疫特性等方面都存在明显差异的一组酶。原级同工酶：基因性同工酶编码基因不同而产生的同工酶。等位基因同工酶：由等位基因编码而产生的同工酶。次级同工酶：翻译后同工酶，酶蛋白的翻译产物，经不同的修饰反应，而产生的不同形式。 15、别构酶：（alloseric E）一种调节酶分子的非催化部位与某些化合物可逆的非共价结合后发生构象的变化进而改变酶活性，称为酶的变构调节，具有该调节作用的酶称为别构酶。通过别构效应降低酶活性的抑制剂称为别构抑制剂。16、酶活力（enzyme activity)：酶催化某一反应的能力，大小可以用在一定条件下催化某一化学反应的能力来表示。17、酶活力单位：特定条件下，1min内，能转化1 mol底物所需要的酶量。18、比活力: 每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。（U/mg蛋白）比活力越高，表示酶制剂越纯。19、酶的活性部位（active site）：活性中心是酶与底物结合，形成E-S复合体，并将底物转化为产物的部位。活性中心是一个三维体，只占酶体积的一小部分，通常位于酶分子表面的缝隙内，底物就通过次级键在该部位与酶结合。20、自杀性底物（suiside substrate）：是指那些底物类似物能为酶所催化，其形成产物与酶的活性中心共价结合，不可逆地抑制酶的活性的物质。21、竞争抑制（competitive inhibition）:抑制剂与酶的正常底物结构相似，它与底物竞争的结合到酶活性中心，从而阻碍酶与底物的结合。22、非竞争抑制（non-competitive inhibition）：非竞争抑制剂与酶活性中心以外的其它位点可逆性结合，其结构与底物无共同之处，底物与抑制剂无竞争关系。23、反竞争抑制（uncompetitive inhibition）：抑制剂不与酶结合，仅与酶和底物分子形成的中间复合物结合，使中间复合物ES明显下降，酶的活性被抑制。24、效应物（effecter）：不作用于活性中心，而是活性中心以外的部位，引起分子构象变化，来调节酶活力的物质。25、协同指数（cooperative index, CI）：也称饱和比值（saturation ratio, Rs) E分子中的结合位点被S饱和90%和饱和10%时S的比26、酶原（zymogen）：酶的无活性前体，通常在有限度的蛋白质水解作用后，转变为具有活性的酶。27、催化亚基和调节亚基：酶分子上负责对底物分子结合和催化的亚基，酶分子上负责调节物，对催化中心的酶活性起调节作用的亚基。28、米氏常数（Km值）：用m值表示，是酶的一个重要参数。m值是酶反应速度（V）达到最大反应速度（Vmax）一半时底物的浓度（单位M或mM）。米氏常数是酶的特征常数，只与酶的性质有关，不受底物浓度和酶浓度的影响。29、底物专一性：酶的专一性是指酶对底物及其催化反应的严格选择性。通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应，不同的酶具有不同程度的专一性，酶的专一性可分为三种类型：绝对专一性、相对专一性、立体专一性。30、辅基：酶的辅因子或结合蛋白质的非蛋白部分，与酶或蛋白质结合得非常紧密，用透析法不能除去。31、抑制剂：能使酶的必需基团或酶活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶的催化活性甚至使酶的催化活性完全丧失的物质。32、诱导酶：是指当细胞中加入特定诱导物后诱导产生的酶，它的含量在诱导物存在下显著增高，这种诱导物往往是该酶底物的类似物或底物本身。问答题一、为什么酶具有高催化效率？（催化原理） 催化本质降低反应的活化能1.邻近定向：E与S结合形成的中间产物，使s与s，s与e的催化基团的结合于同一分子，大大提高了有效浓度。相当于将底物从溶液中取出来，使它们固定在酶分子表面的活性中心部位，它们的反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子的轨道以正确方位相互交盖，大大提高了反应效率。2、扭曲变形和构象变化的催化效应3、酸碱催化：酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对底物进行酸碱催化。4、金属离子催化5、共价催化6、微环境的影响：X射线衍射研究指出，酶能设置不寻常的反应环境，例如溶菌酶分子上形成活性中心裂缝中，排满了许多疏水氨基酸侧链非极性环境，更利于反应，利于敏感键极化。二、酶活力的测定方法及测定时应注意的问题？1、终点法（化学反应法）：对于SP反应，间隔一定时间，分几次取出一定体积的反应液，用化学法或物理法立即终止酶反应，然后测定S或P的量。2、动力学法：a、分光光度法：在酶促反应中，利用反应物或产物在紫外光或可见光区域内有光吸收的特性。b、荧光法3、酶偶联法：是在被测定的酶反应系统中，加入过量的高度专一的“偶联工具酶”使反应继续进行到某一可直接准确测定的阶段。4、电化学法：是用离子选择性电极跟踪反应过程所生成的离子或气体分子的浓度，从而得到反应物的初始浓度。应注意的问题：1、严格控制实验条件，最适温度、最适pH 2、ES 3、做对照实验 4、酶液不宜放置过久 5、有些反应不一定在水溶液中进行三、酶活力的可逆抑制有哪些类型？如何区分？1、竞争抑制:抑制剂与酶的正常底物结构相似，它与底物竞争的结合到酶活性中心，从而阻碍酶与底物的结合。2、非竞争抑制：非竞争抑制剂与酶活性中心以外的其它位点可逆性结合，其