枯草芽孢杆菌产胞外淀粉酶高产菌株的选育讲义.doc

枯草芽孢杆菌产胞外淀粉酶高产菌株的选育在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理微生物，使基因发生突变，可能导致微生物提高或者减低合成某一物质的能力。物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、射线等。诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。用诱变剂处理微生物，一般要求微生物呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，处于该期的细菌对诱变剂最敏感。必须选择合适的剂量进行诱变处理，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。绝对剂量的单位以尔格/cm2表示，一般用相对剂量。相对剂量与3个因素有关：诱变源和处理微生物的距离、诱变源（紫外灯）的功率、处理的时间。前2个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。处理不同微生物的最适剂量是不同的，须经预备实验确定。本综合实验利用紫外线诱变枯草芽孢杆菌悬浮的菌体，分析不同参数下的紫外线致死率及诱变率，筛选产量提高的产淀粉酶菌株。学习物理因素诱变育种的方法，并掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法，最终从诱变菌株中筛选出淀粉酶活力较高的菌株。实验一 紫外诱变及高产菌株的初筛（一）实验目的通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。（二）实验材料与用品菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)；仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机。（三）实验内容与方法（1）菌悬液的制备a) 取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面45 支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。b) 将上述菌液离心（3000r/min，离心 15 分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤23次，最后制成菌悬液。c) 用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升 108个。（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至 55左右时倒平板，凝固后待用。（3）紫外线处理a) 将紫外线灯开关打开预热约 20分钟。b) 取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液 5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。c) 将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为 30cm，功率为 15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。（4）稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10 倍稀释法稀释成 10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。（5）涂平板取 10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板 3只，每只平板加稀释菌液0.1 ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。（6）培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37培养 48 小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。（7）计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理 1分钟、3 分钟后的存活细胞数及其致死率。（8）观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在56 个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。（四）实验作业记录实验数据，分析实验结果并进行讨论，撰写实验报告。实验二 高产菌株的鉴定（一）实验目的1掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法；2从初筛所获得的诱变菌株中筛选出淀粉酶活力高的菌株。（二）实验原理淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括-淀粉酶、淀粉1，4-麦芽糖苷酶（-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。-淀粉酶可以从淀粉分子内部切断淀粉的-1，4糖苷键，形成麦芽糖、含6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可以用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定-淀粉酶的活力。（三）实验用品1粗酶液实验一保存的HC比值大的菌落进行摇瓶发酵，发酵液离心后可作为粗酶液。2试剂碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500ml，贮于棕色瓶中；比色用稀释碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500ml，贮于棕色瓶中；2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀，徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100ml，需当天配制；pH6.0的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）4.523g，柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至100ml；0.5mol/L乙酸溶液。3器材离心机，分光光度计，恒温水浴锅，试管架，秒表；试管，移液管，烧杯，离心管。（四）实验方法1标准曲线的绘制：表21标准曲线的制作试 剂管号123456淀粉稀释液浓度/%00.20.51.01.52.0淀粉稀释液/ml222222缓冲液/ml11111140水浴中保温5min蒸馏水/ml11111140水浴中保温30min，加入0.5mol/L乙酸10ml，混匀后吸取反应液1ml稀碘液/ml101010101010A660将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀释液；吸取淀粉稀释液2.0ml加至试管中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.0ml，40水浴保温15min；加蒸馏水1ml，40保温30min后加入0.5mol/L乙酸10ml；吸取反应液1ml，加入稀碘液10ml，混匀，在660nm下测吸光值A；以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。2酶液的制备将发酵液离心（5000r/min，10min），取上清液作为粗酶液，以pH6.0缓冲液稀释至适当浓度，作为待测酶液。3淀粉酶活力测定按下列程序操作：试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）加2%淀粉稀释液2.00ml加2%淀粉稀释液2.00ml加缓冲液1.00ml（摇匀）加缓冲液1.00ml（摇匀）400.2，5min400.2，5min加蒸馏水1.00ml（摇匀）加粗酶液1.00ml（摇匀）400.2，30min400.2，30min加乙酸10.0ml加乙酸10.0ml混匀混匀取反应液1.00ml取反应液1.00ml加稀碘液10.00ml加稀碘液10.00ml混匀混匀测定A660测定A660（五）注意事项1淀粉一定要用少量冷水调匀，再倒入热水中溶解，若直接加到热水中，会溶解不均匀，甚至结块。淀粉液应当天配制，配好的淀粉液应是透明澄清的，不能有颗粒状物质存在。2酶液应该进行适