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中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 姓名： 周梦阳 专业年级： 07生物技术 学号： 040012007184 实验时间：周二90节 教师： 孔凡娜 课程： 分子生物学实验 题目： 基因组DNA的提取与电泳鉴定 一.【实验目的】掌握基因组DNA的提取原理和方法二.【实验原理】1、用机械的方法使组织和细胞破碎；加入SDS等离子型活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白；加入酚氯仿等表面活性剂使蛋白变性。离心，除去组织和变性蛋白，上清液中加入冰冻的无水乙醇使DNA沉淀，离心，弃上清，70%乙醇漂洗DNA；倒掉上清，风干，溶于灭菌的双蒸水中。2、分子置于电场中以一定速度（迁移率）移向适当电极。迁移率同电场强度、电泳分子所携带的静电荷数成正比，还与介质的摩擦系数相关。一定电场强度下DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。3、琼脂糖是D-和L-半乳糖残基残基通过(13)和(14)糖苷键交替构成的线状聚合物。琼脂糖凝胶可以形成直径50nm-200nm的三维筛孔通道。琼脂糖溶液的密度取决于琼脂糖的浓度，我们所用的是经过化学修饰的低熔点（LMP）琼脂糖，结构上比较脆弱，较低温度下即可熔化。浓度越高，孔隙越小，分辨能力越强。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50Kb；聚丙烯酰胺凝胶分辨力为1bp-1000bp。4、凝胶电泳中，加入溴化乙锭（简称EtBr）染料对核酸分子染色之后，将电泳标本放置在紫外光下观察，便可以十分敏感儿方便地检测出凝胶介质中DNA的谱带位置。三.【实验材料与用品】材料：龙须菜用具：天平、离心管、高速离心机、水浴锅、琼脂糖凝胶电泳系统、琼脂糖凝胶电泳系统等。药品：液氮、缓冲液、SDS、蛋白酶K、tris饱和酚、氯仿、冰冻的无水乙醇、70%乙醇、RNA酶、TBE、琼脂糖四.【实验步骤】（一）基因组DNA的提取（1）将龙须菜从培养瓶中取出，吸干表面水分后用电子天枰秤取0.2g，液氮充分研磨后分装到1.5ml的离心管中。（2）在装有藻体粉末的离心管中加入900l提取缓冲液、90l 20%的SDS、10l 10mg/ml的蛋白酶K。充分混匀后于37水浴锅中裂解30min，每5min混匀一次。（3）12000转离心10min，取上清。（4）加入等体积Tris饱和酚抽提，充分混匀后12000转离心10min，取上清。（5）加入等体积氯仿抽提，充分混匀后12000转离心10min，取上清。（6）加入等体积氯仿抽提，充分混匀后12000转离心10min，取上清。（7）加入两倍体积的无水乙醇，充分混匀后于-20半小时。（8）将上述溶液从冰箱中取出，12000转离心10min，出现的沉淀即为基因组DNA。（9）倒掉上清，加入800l 70%的无水乙醇，洗沉淀，12000转离心10min。洗两次。（10）倒掉上清后，将沉淀晾干后加入50去离子水溶解。 （11）加入Rnase消化30min。（12）-20保存备用（二）基因组DNA的电泳检测（1）配制1%的Agarose胶(1gAgarose粉末，融于100ml1TAE中)（2）分别在样品槽中加入标准DNA marker和样品DNA 3l（buffer与样品DNA的混合物），电泳。（3）将琼脂糖胶放在EB溶液中染色5-10分钟。（4）使用凝胶成像系统拍照并检验。五.【实验结果】我们是第2组，由下图可见无明显条带，这说明样品中混有蛋白质杂质，抽提不完全。六.【思考题】1、简述DNA提取过程中各种试剂的作用。SDS：破坏细胞膜结构，使蛋白质变性，解聚核糖体，使DNA得以释放。蛋白酶K：降解蛋白质乙醇：沉淀DNATris：缓冲液EDTA：螯合剂，螯合酶活性中心的金属离子，从而抑制DNase的活性酚氯仿：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚抽提过程中，蛋白质与DNA分离，蛋白质与苯酚相似相溶，DNA溶于水相，离心分离后保持水相，加入酒精沉淀DNA。重蒸水：吸取DNA上面所粘附的离子RNA酶：降解混杂在DNA 中的RNA 2、简述DNA提取过程中需要注意哪些问题。1）材料量不能太多,氯仿的加入量不能太少,且要充分摇匀,否则蛋白质变性不完全。2）苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。3） 操作要快，酚暴露在空气和光线下易被氧化，呈红色。4）收集细胞的多少是实验成功与否的关键；5）沉淀中加1ml STE后，打散细胞团便于充分消化细胞；6）饱和酚吸取时记得吸取下层的有机相；7）乙醇沉淀时，要沿离心管壁向DNA溶液中加入无水乙醇，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA。3、查阅资料简单介绍通过紫外分光光度计给核酸定量的原理。分光光度计计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于