SNP检测方法.ppt

1 SNPs的检测方法 2007 4 12 2 SNPs的定义 定义 单核苷酸多态性 singlenucleotidepolymorphisms SNPs 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性 99 9 3 SNPs的研究意义 1 SNPs作为第三代遗传标记 已知性 可遗传性 可检测性 用于疾病基因的定位 克隆和鉴定 路标的作用传统研究策略 表征 蛋白 基因 逆向遗传学 表型 基因 蛋白 4 2 基因多态性研究研究SNPs本身对机体的影响 生理特征 病理条件下的千差万别 5 SNPs研究进展和方向 1 SNPs数据库的构建发现2 SNPs功能的研究 在1的基础上 6 SNPs检测方法 1 理想的检测SNPs的方法 发现未知的SNPs 或检测已知的SNPs 1 灵敏度和准确度的要求 反应原理严紧 2 快速 简便 高通量 操作和分析的自动化程度高 3 费用相对低廉 7 2 现状 到现在还没有一个符合以上条件的理想方法出现 但根据实际情况 可以选择出较合适方法 8 3 每种SNPs的检测方法都可将之看成由区分SNPs特异位点的原理方法和数据的检测分析手段两部分组成 9 SNPs检测方法的分类 一 区分SNPs位点的方法1 基于杂交的方法2 基于酶的方法3 以构象为基础的方法4 直接测序的方法 二 检测分析技术1 凝胶分析技术2 荧光检测技术3 DNA芯片4 质谱检测技术 10 1 基于杂交的方法 原理 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时 完全匹配和有错配两种情况下 根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs位点检测出来 差异越大 检测的特异性就越好 11 1 利用 Tm 固定温度等位基因特异核苷酸探针 Allele specificoligonucleotide ASO 修饰过的探针 引入一个错配的碱基 PNA LNAs等动态的加热过程 动态等位基因特异杂交 dynamicallele specifichybridization DASH 12 核酸肽探针 Peptidenucleicacids PNA 其骨架是肽键特点 1 与靶分子高特异性地结合 3个方面的影响 2 链挤入 形成三链复合结构 表达调控以及反义治疗方面 3 对核酸酶和蛋白酶均不敏感 体外应用 13 1 与靶分子高特异性地结合 Tm值高受盐浓度影响小 低盐浓度的体系 Tm更大 一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8 20度 所以 PNA DNA的非特异结合能得到很好的排除 14 LNA lockednucleicacids 其结构是在RNA分子的2 羟基和核糖环的4 碳原子间连入一个亚甲基的 桥 特点 1 能以很高的亲和性和互补的DNA RNA或LNA结合 构象更利于杂交的稳定 2 匹配和不匹配的 Tm增加 15 DASH dynamicallele specifichybridization 16 2 杂交 荧光共振 分子信标 双分子间杂交 蝎状探针 分子内杂交 17 分子信标 Molecularbeacons 18 蝎状探针 Scorpionprimer 19 2 基于酶的方法 1 DNA聚合酶2 连接酶3 限制性内切酶4 外切酶FEN5 RNaseH 20 1 DNA聚合酶 等位基因特异性PCR多重等位基因特异性PCRTaqman法引物延伸法焦磷酸测序法 21 等位基因特异性PCR 22 Taqman法 23 微测序法 引物延伸法 24 基本步骤 液相 1 设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA2 对PCR产物进行纯化 去除引物和dNTP 3 引物延伸4 延伸产物检测 放射性同位素标记法 发光检测法 凝胶为基础的荧光检测法 质谱分析法 变性高压液相色谱法等 25 APEX arrayedprimerextension 固相 26 焦磷酸测序法 Pyrosequencing DNA聚合酶 ATP硫酸化酶 ATPsulfurylase 荧光素酶 luciferase 和三磷酸腺苷双磷酸酶 apyrase 原理 DNA聚合酶在一种dNTP的存在下进行引物延伸反应 而引物的成功延伸将伴随焦磷酸的释放 焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种发化学发光反应 通过发光计的实时监测来达到检测的目的 27 基本步骤 1 测序引物和DNA模板杂交 PCR扩增的 单链的 与酶和底物孵育 2 四种dNTP dATPS dTTP dCTP dGTP 之一被加入反应体系 如与模板配对 与引物的末端形成共价键 dNTP的焦磷酸基团 PPi 释放出来 3 一系列的酶学反应 发出可见光信号 每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比 4 ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解 淬灭光信号 并再生反应体系 5 然