微生物检测APC法有效性.doc

化妆品微生物检测APC法有效性评价实验化妆品微生物检测APC法有效性评价实验化妆品微生物检验方法，好氧平板计数法（APC法），检查对象主要包括细菌总数、霉菌总数及控制菌（化妆品中主要对象是粪大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌），目前广泛应用于化妆品产品检验、原料检验及产品防腐效能测试，是对原料、产品微生物学质量进行判定的主要手段。绝大多数化妆品都会添加部分防腐剂以达到产品抗菌目的，目前APC法的基本过程是：将样本（或稀释后的样本）加入培养基中混合均匀后规定条件培养计数，那么按APC法，加入样本后的培养基中必然还存在样品本身固有的防腐剂，该防腐剂的存在是否能够继续产生杀灭或抑制细菌的作用，对检测数据是否能产生影响？从APC法标准步骤来进行分析，稀释过程（我们通常选择10倍稀释）和APC 法使用的吐温80、卵磷脂营养琼脂培养基中的中和剂（吐温80、卵磷脂）是该方法为消除防腐剂干扰的主要手段。基于上面的考虑，我们选择工厂产量最大的作为实验样本，通过稀释效应测定和中和效应测定，来判断该品种使用APC法所获得数据的真实性：一、稀释效应实验：稀释效应实验依据:任何防腐剂都存在一个最小抑菌浓度，即当防腐剂浓度低于该浓度时，防腐剂无效。我们现有细菌总数测定的方法是将样品稀释至10%，然后吸取1mL到平板，加入15mL培养基，然后放置于培养箱中培养计数，计算后得到最终培养基中含样品的数量为0.6%，那么培养基中残留防腐剂量为产品中的0.6%，在该浓度下，防腐作用是否能继续发挥作用，直接反映该稀释过程能否消除掉防腐剂的作用。1.实验菌的选择： G-杆菌，端生孢子，菌落形态肉色，菌落生长有一定的扩散性。2005年元月水剂储罐平台收集菌。2.旧版（防腐剂为卡松、酒精），新版（防腐剂为卡松、DMDMH、酒精）。3.实验方法：将样品配制成6%的水溶液（无菌水），然后取10mL加入90mL氯化钠蛋白胨溶液中，加入1mL已知浓度的菌液，混合均匀后放置于38培养箱，定期测定含菌量。空白实验为无菌氯化钠蛋白胨溶液。4.实验结果： 品种检测时间 （旧配方） （新配方） 空白0h 140 150 15024h 130 120 30048h 100 110 1000+72h 80 70 不可计5.实验分析：通过上面测试可以看出，产品仅仅依靠10倍的稀释,残留防腐剂依旧起到抑制加入菌生长的作用。因此，我们通常使用的10倍稀释，是无法屏蔽掉防腐剂的作用的。既然普通的10倍稀释无法保证完全消除防腐剂的干扰，那么培养基本身所含有的吐温80、卵磷脂是否能够起到中和（屏蔽）防腐剂的作用，则成为我们常规方法是否可靠的关键因素。二、吐温80+卵磷脂中和效率实验：吐温80+卵磷脂的中和原理分析：吐温80+卵磷脂是个优良的乳化剂对，利用乳化或增溶的原理将防腐剂进行包裹，从而降低样品水相中的防腐剂浓度，达到屏蔽防腐剂作用的目的。实验一，在样品中接种选定菌，分别用卵磷脂+吐温80营养琼脂培养基和普通营养琼脂培养基（不含卵磷脂+吐温80）进行细菌总数测定；实验二，实验一中的稀释剂中加入吐温80+卵磷脂做中和剂，同样品的中和时间保持在5-10分钟，接种，用普通琼脂培养基进行培养；实验三，实验一中的接种后的样本稀释液用滤膜过滤，使用普通营养琼脂培养基进行培养计数。空白实验，测定实验样品中的细菌底数。实验中使用培养基均使用TTC。1.试样：同稀释效应评价实验。 2.实验菌：同稀释效应评价实验用菌。3.仪器及药品：广州环凯提供的卵磷脂+吐温80营养琼脂培养基、普通营养琼脂培养基（不含卵磷脂+吐温80）、TTC溶液、吐温80、卵磷脂；氯化钠-蛋白栋溶液（自配）；60mm G3玻璃砂芯漏斗；60mm 0.45m醋酸纤维滤膜；真空抽滤装置。4.实验步骤：a.菌液组：1mL菌液加入9mL无菌氯化钠-蛋白胨（pH7.0）缓冲液的试管中，平皿法计算结果。b.试验组1：把10g样品加到90mL无菌氯化钠-蛋白胨（pH7.0）缓冲液中，混匀制得1:10的供试液，吸取此供试液9mL到无菌空试管中，加入1mL实验菌液。再次混匀。分别使用两种培养基，按照平板计数法测定其含菌量。c.试验组2：氯化钠-蛋白栋溶液中按0.7%和0.1%比例加入吐温80、卵磷脂，灭菌处理。取该稀释液按试验组1的步骤操作，样品的中和时间保持在10分钟，然后吸取此供试液9mL到无菌空试管中，加入1mL实验菌液。再次混匀。使用普通培养基，按照平板计数法测定其含菌量。d.试验组3：把10g样品加到90mL无菌氯化钠-蛋白胨（pH7.0）缓冲液中，混匀制得1:10的供试液，吸取此供试液9mL到无菌空试管中，加入1mL实验菌液。再次混匀。然后吸取1mL，用滤膜进行抽滤，吸取试液用吸管用10mL稀释液反复冲洗，冲洗液进行抽滤。滤膜贴在普通营养琼脂培养基表面进行培养计数。e.空白对照组：把10g样品加到90mL无菌氯化钠-蛋白胨（pH7.0）缓冲液中，混匀制得1:10的供试液，按平皿法计算供试品的含菌量。使用两种不同的培养基。5.实验结果：样品结果组别 旧配方 新配方菌液组（平均） 12 12试验组1a卵磷脂+吐温80营养琼脂培养基 9 10试验组1b普通培养基 1 0试验组2（平均） 8 9试验组3（平均） 11 10空白组 0 06.实验分析：通过对比试验1a同试验1b的数据，可以看到，在没有卵磷脂+吐温80的普通琼脂培养基中，接入菌基本没有生长，即样品中残留的防腐剂起到了抑制细菌生长的作用。试验2在稀释液中加入了卵磷脂+吐温80，培养过程则使用普通琼脂培养基，获得数据同试验组1a基本吻合，进一步说明了卵磷脂+吐温80的中和效率；试验3则用普通稀释剂，采用膜过滤法，把接入菌拦截到滤膜上，则培养计数过程无防腐剂残留问题，结果获得数据同试验1a基本吻合。该实验，充分证明在上面两款产品的微生物测定中，卵磷脂+吐温80对防腐剂的中和效率是明显的。通过上面的两个实验，可以看出防腐剂残留对实验结果的干扰是必然存在的，就上面的实验样本而言，吐温80-卵磷脂的中和效应，是消除该干扰的主要手段。值得注意的是化妆品防腐剂种类的多样性，如尼泊金脂系列、卡松、DMDMH缓释甲醛系列、苯氧乙醇系列、含卤素系列，甚至多种防腐剂复配而成的新防腐剂等等，其防腐机理及理化性能均存在较大的差异。同时不能忽略的化妆品中使用原料的防腐抗菌作用，比如说目前洗发水中的甘宝素、ZPT，护发素中的阳离子表面活性剂、玉洁新DP300等等，都对产品或者说体系的防腐能力存在很大的影响。如实验样本中卡松、DMDMH、酒精三者的协同效应。那么对于具有不同防腐体系产品进行APC法检验，APC法的稀释效应和中和效应（吐温80+卵磷脂）是否能够起到作用，是否对任何防腐体系全部有效，就成为我们检验数据是否准确的关键因素。试想，如果出现实验1b类似的问题，即由于吐温-卵磷脂不具备防腐剂中和能力，同时稀释效应无效，那么我们获得的数据必然出现巨大的偏差，一旦出现该问题，其影响无疑是可怕的。因此，对具有不同类型防腐体系的产品，建立并开展APC法有效性评价的实验，是使用APC法所获得数据有效性和真实性的前提条件。根据对的实验所获得的经验，我们设计以下的有效性评价实验方法：1.尽量以工厂优势菌为选取对象，保持选择菌的纯度即选择单一的菌，同时注意G-和G+菌的选择，保证选菌的全面性。说明：日常APC法检验，主要表明的是产品经过生产系统后的微生物学状况，选择生产环境中的优势菌具有很好的现实意义，同时根据现有实验条件，按照革兰氏染色镜检结果进行分类，可保证实验菌的相对纯度，避免实验中的干扰（如保持菌落形态的一致而方便计数，培养基支持性差异影响可忽略等）。2.按我们测定的方法时使用的最低稀释倍数（10倍）作为实验样本，进行接种操作，接种数量控制在10-100cfu/mL。说明：选择相对较小的接种浓度，便于最后的计数，避免菌落点数时的误差。同时接种数量不宜过小，应保持在10以上，否则在吸取菌液时的误差对实验结果的影响相对较大。3.按实验1的操作，如果实验1回收菌数量同菌液组（接种量）数量出现较大差异，可以计算回收率（试验组回收菌数占菌液组的菌数的百分比），最低回收率可根据实验过程控制精度来选择，这里我们选择70%，若回收率低于设定的最低回收率，则有效性评价实验不予通过。应考虑是否因吐温80、卵磷脂中和剂中和效率不足而需要进行替换。说明：通过回收率的计算，可以相对量化的表现其中和效率或者实验的有效性。4.按实验2更换中和剂后重复测试，直到回收菌的数量同接种数量保持在70%以上。中和剂的选择根据具体产品结构特点进行合理选择。（可参考以下GB 15982-1995医院消毒卫生标准方法：对于醇类与酚类消毒剂，稀释液用普通营养肉汤即可；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂、过氧化物消毒剂，需在肉汤中加入0.1%硫代硫酸钠；对于洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在肉汤中加入3%（W/V）吐温80和0.3%卵磷脂；对于醛类消毒剂，需在肉汤中加入0.3%甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种复方消毒剂，需在 肉汤中加入3%（W/V）吐温80，以中和被检样液的残效作用。）5.如果无法找到合适的中和剂来屏蔽掉产品防腐剂的干扰，则必须按照实验3（滤膜结合TTC显色的方法）的方法来进行操作，其回收菌的数量也应该同接种数量保持基本相当。根据上面的设计步骤，我们再次对以下ABC,3个品种进行了测定。1.实验步骤（略）2.实验结果：样品结果组别 A B CG-芽苞杆菌 ATCC9372 G-芽苞杆菌 ATCC9372 G-芽苞杆菌卵磷脂+吐温80营养琼脂培养基 55 48 49 37 64普通培养基 2 35 1 20 3菌液组 69 50 69 50 80供试样对照组（空白组） 0 0 0