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黑麦Waxy基因的分离和鉴定摘 要：编码颗粒结合型淀粉合成酶（GBSSI）的Waxy基因的基因组序列和cDNA序列已被从黑麦中分离出来并予以鉴定，黑麦Waxy基因的基因组DNA和cDNA全长分别为2767bp和1815bp，黑麦Waxy基因组序列有11个外显子、10个内含子，黑麦Waxy基因富含GC，而且GC频率在编码区中更高，特别是在密码子的第三个位置。与其它禾谷类作物的同源序列相比，黑麦Waxy基因外显子区域比内含子区域更加保守，黑麦成熟的GBSSI蛋白与小麦和大麦中同源蛋白序列的一致性超过95。用黑麦和其它植物GBSSI的蛋白质序列构建的系统进化树揭示了它们之间的进化关系，黑麦Waxy基因的鉴定将有助于掌握黑麦和小黑麦淀粉的代谢。关键词：黑麦，Waxy基因，GBSS，系统进化树引言 黑麦（Secale cereale L.）是世界上一个重要的谷类作物，黑麦籽粒主要用于做动物饲料和酿酒，而在较小程度上用于食品（Bushuk 2001），与其他主要谷类作物（小麦、大麦、燕麦）相比，黑麦的粮食市场需求较低。因此，黑麦在加拿大的种植面积比较小。然而，黑麦的一些积极特殊属性，如优秀的抗寒性，优异的抗旱性及抗病能力，使得黑麦抗性基因被广泛应用到小麦中（Rabinovich 1998）。黑麦的一些特性被保存在了小黑麦一个将小麦和黑麦人工杂交后得到的物种中（Briggs 2001），我们正探索将小黑麦作为加拿大西部新的生物产业性作物的可能。淀粉是谷物中最丰富的多糖，它在谷物的外观、结构和食品质量等方面扮演着非常重要的角色（Hung et al. 2006），在种子胚乳中淀粉颗粒的合成和发展是一个复杂的代谢过程，其中涉及到至少4个不同类别的酶：ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADPase;EC 7）,淀粉合成酶（SS;EC1），淀粉分支酶（SBE;EC 8）和淀粉去分支酶（DBE;EC 1或EC8）（Nakamura and Yamanouchi 1992; Villand et al. 1992; Ball et al. 1996; Tomlinson and Denyer 2003）。现已在多种植物中发现了SS的异构体，可将其划分为5类，即颗粒结合型淀粉合成酶（GBSS）、SSI、SSII 、SSIII和SSIV（Tomlinson and Denyer 2003; Tetlow 2006）。所有SS的同工酶，负责将葡萄糖残基从ADPG转移到-1,4-葡聚糖非还原端用以延长直链淀粉或支链淀粉，SS的同工酶都有一个N端信号肽、一个N端非催化域和一个C端催化域。（Tetlow et al. 2004; Senoura et al. 2007）。 编码GBSS的基因，也被称为Waxy基因，在多种植物中已得到了鉴定，该酶有两个同工酶（GBSSI和GBSSII），其中GBSSI是主要在籽粒胚乳中表达异构体(Fujita and Taira 1998; Vinten and Nakamura 2000）。以往的研究表明GBSSI与淀粉颗粒牢固结合并对直链淀粉链的延长具有特殊功能（Tetlow et al. 2004）。编码GBSSI序列的Waxy基因和cDNA已分别从小麦（Murai et al. 1999），水稻（Wang et al. 1990），大麦（Rohde et al. 1988），玉米（Klosgen et al. 1986），马铃薯（van der Leij et al. 1991），豌豆（Dry et al. 1992），高粱（Hsieh et al. 1996），木薯（Salehuzzaman et al. 1993）中得到分离和鉴定。虽然曾从黑麦中鉴定到一条Waxy基因的部分序列（GenBank 登录号：AY011009）然而，在公共数据库中还没有关于分离和鉴定黑麦全长Waxy基因的科学报道。在这项研究中，我们分离到了黑麦Waxy基因的基因组和cDNA序列，分析了Waxy基因及其GBSSI的结构和结构域特征，揭示了黑麦和其他植物的GBSSI在进化上的关系。材料与方法六倍体春小麦（中国春）和二倍体春黑麦（黑麦属Rogo）生长于人工可调控的同一培养箱中（白天24，夜晚20 ，光周期16小时，光强240mmol/m2.s1)，在相同的生长条件下，样品取Zadoks 22期的幼嫩叶片和开花后12天的未成熟种子（Tottman et al. 1979），液氮速冻后-80保存备用。用DNeasy Plant Mini Kit从叶片中提取基因组DNA（Cat. No. 69104,QIAGEN Inc., Mississauga, Ontario, Canada）。根据酚-SDS（Palmiter 1974）操作步骤，从未成熟种子中分离得到总RNA，使用DNeasy Plant Mini Kit（Cat. No. 74904, QIAGENInc.）进一步纯化RNA。克隆黑麦Waxy基因所用PCR引物是根据一粒小麦（Triticum monococcum ）Wx-TmA基因（GenBank登录号：AF110373），节节麦（Aegilops tauschii）Wx-TsB基因序列（GenBank 登录号：AF110374）和山羊草Wx-TtD序列（GenBank 登录号：AF110375）的保守区域设计的，设计了五对引物用以扩增黑麦Waxy基因的基因组DNA序列，根据本研究中确定的黑麦Waxy基因的基因组序列和普通小麦Wx-7A（GenBank登录号：AB019622）、Wx-4A（GenBank登录：AB019623）和Wx-7D（GenBank登录号：AB019624）的序列信息（Murai et al. 1999），另外设计了两对引物用以扩增Waxy基因的cDNA，在通常情况下， 25l 的PCR反应体系为：20pmol引物，30ng基因组DNA或12.5ngcDNA，1buffer，1Q-solution，1.25U QIAGEN HotStar HiFidelity DNA 聚合酶（Cat .No 202605, QIAGEN Inc.）。根据供应商（Cat No.18080-093,Invitrogen,Ontario,Canada）的说明操作，反转录以总RNA为模板，用Superscript反转录酶在42条件下反应50分钟。引物序列和PCR条件列于表1。把Waxy基因扩增的片段连接到PCR4-TOPO载体（Cat No.K4575-02, Invitrogen）上，每个片段至少挑选3个独立的阳性克隆送到Calgary大学DNA测序服务中心进行正反两个方向的测序（加拿大阿尔伯塔省，卡尔加里大学）。黑麦Waxy基因序列和GBSSI蛋白序列用NCBI的在线blastn工具进行检索（），用DNAMAN5.0和已报道的Waxy序列进行比对（Lynnon BIOSOFT, USA）是一致的。用ClustalW程序（http:/www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw）对黑麦GBSSI，小普通麦GBSSI（WX-7A；GenBank 登录号： AB019622），大麦GBSSI（GenBank 登录号：X07931），水稻GBSSI（GenBank 登录号：X53694），小麦SSIII（GenBank 登录号： AAF87999），菜豆SSIII（GenBank登录号：AB293998），拟南芥SSIII（GenBank 登录号：DQ241810）的淀粉结合结构域的氨基酸序列进行比对。在GBSSI蛋白质的基础上，通过分析黑麦、普通小麦（GenBank登录号：AB019622, AB019623, AB019624），一粒小麦（GenBank登录号：AF110373），拟斯卑尔脱山羊草（GenBank 登录号：AF110374），节节麦（GenBank 登录号：AF001375），大麦（GenBank登录号：X07931），玉米（GenBank 登录号：X03935），水稻（GenBank 登录号：X53694），高粱（GenBank登录号： U23945），豌豆（GenBank登录号：X88789），马铃薯（GenBank，登录号：X58453），木薯（GenBank登录号：X74106）中14个Waxy基因所编码氨基酸序列的差异构建了GBSSI的系统演化树，用MEGA4.1的邻位相连法构建了展示Waxy基因间进化关系的系统树图（Kumar et al. 2008），获得了这些Waxy基因的关系。结果与讨论黑麦Waxy基因的分离利用植物Waxy基因的保守序列，我们设计了7对PCR引物(表1)，并成功地从小麦基因组和黑麦基因组中扩增到重叠PCR片段，从cDNA中扩增到反转录PCR片段（图1）。当扩增一个以上的DNA片段时，和预测大小对应的片段）需要从从凝胶上切下后作进一步鉴定。我们还用限制性内切酶作图检测了其它的一些PCR扩增片段，确定了这些非预期DNA片段属于非特异性扩增产物，不是黑麦Waxy基因。从小麦基因组中扩增的Waxy的DNA片段和水稻的Wx-7A， Wx-4A和Wx-7D的大小一致，我们观测了大部分引物在黑麦和小麦间扩增情况的差异，这种差异可能来自于两物种间基因组构成的不同和目标序列核苷酸组成的差异。5个不同的覆盖黑麦Waxy基因全长序列的重叠DNA片段和2个覆盖Waxy基因cDNA序列的重叠片段被分离和单独克隆到TOPO载体中并测序，通过拼接PCR片段，我们得到了黑麦Waxy基因的基因组序列和cDNA序列。我们的研究结果表明：黑麦Waxy基因的基因组序列和cDNA序列全长分别为2767 bp（GenBank 登录号：FJ491376）和1815bp（GenBank 登录号：FJ491377）。我们通过比较黑麦Waxy基因组序列和cDNA序列确定了黑麦Waxy基因的内含子位置，并确定了黑麦Waxy基因有11个被10个内含子分割的外显子（如图2A）。在黑麦、大麦、普通小麦、一粒小麦、拟斯卑尔脱山羊草 的Waxy基因组序列中，这些内含子、外显子数量和结构高度保守，按照通用GT-AG规则在二核苷酸序列这10个内含子的5和3末端被证实（Breathnach and Chambon 1981）。黑麦Waxy基因的鉴定植物Waxy基因通常在蛋白成熟前编码信号肽，通过比较小麦GBSSI氮端推导出的氨基酸序列和黑麦中的同源序列，我们确定了黑麦Waxy基因的cDNA中编码信号肽和成熟蛋白的序列长度分别为210bp和1605bp，并且和数据库中其他植物的Waxy基因具有高度一致性，通过序列比对表明，黑麦Waxy 基因1a的部分片段和本研究中分离出的Waxy基因具有同源序列，而外显子区的序列一致性则高达95.6。我们发现，植物Waxy基因外显子区域的序列差异主要是由于核苷酸的替换和仅在Wx-TmA，Wx-TsB和Wx-4A信号肽中出现的密码子的插入（图2B）。在植物Waxy基因的内含子区域的差异主要是核苷酸的替代、插入和删除导致的。我们确定，黑麦和其它作物Waxy基因内含子区域的DNA序列一致性为63.2-73.4之间，内含子总体上比外显子区（91.6-97.4）的一致性低（表2）。我们的结果表明，谷物Waxy基因在外显子区域的DNA序列是高度保守的，这是与先前的报道高粱、水稻和玉米基因组（Chen et al. 1998）的结果是相一致的，表明单子叶植物基因内含子的进化率比外显子区域高。我们计算了来自14个不同植物的基因组Waxy基因编码区的GC含量，得到每个密码子在信号肽区和成熟蛋白区的位置。我们的结果表明，GC含量在单子叶植物（黑麦、小麦、一粒小麦、拟斯卑尔脱山羊草、节节麦、大麦、玉米、水稻、高粱）和双子叶植物（木薯、马铃薯、豌豆）间差异很明显，前组密码子第三位点的GC含量非常高，黑麦Waxy基因信号肽区和成熟蛋白区GC总含量分别为71.4和64.3，在密码子第三位点GC含量分别为84.2和95.0。我们发现黑麦Waxy基因的GC含量比1860个小麦Waxy基因的编码区GC含量平均值56.0（http:/www.kazusa.or.jp/codon）和密码子第三位置的65.0要高，这表明黑麦Waxy基因比小麦Waxy基因表现出更大的GC互补偏置。Fig. 1. DNA banding patterns of wheat (T. aestivum Chinese Spring) and rye (S. cereale Rogo) Waxy genes amplified by different PCR primer sets. Lanes 1 and 2, Rye-wx-F15/R15; lanes 3 and 4, Rye-wx-F13/R13; lanes 5 and 6, Rye-wx-F7/R7; lanes 7 and 8, Rye-wx-F8/R8;lanes 9 and 10, Rye-wx-F9/R9; lane 11, Rye-wx-F17/R17; and lane 12, Rye-wx-F19/R18. Chinese Spring genomic DNA was amplified inlanes 1, 3, 5, 7, and 9; Rogo genomic DNA was amplified in lanes 2, 4, 6, 8, and 10; Rogo cDNA was used in lanes 11 and 12. DNA fragments with the predicted or expected sizes are enclosed in boxes (red boxes in the online version of this paper); these rye ampliconswere isolated for further characterization. M, OGeneRuler DNA Ladder Mix (100 bp 10 000 bp) (Fermentas Life Sciences). the third codon position) of 1860 wheat genes (http:/www. kazusa.or.jp/codon), which indicates that the rye Waxy gene exhibits a greater GC bias than the wheat gene complement.黑麦GBSSI蛋白分析 在黑麦Waxy基因基因组的全长DNA和cDNA序列的基础上，我们推断出黑麦GBSSI蛋白由604个氨基酸残基组成，包括70个氨基酸的转运肽，翻译成信号肽和成熟蛋白的分子量为7.27 kDa和58.82 kDa的。预测黑麦Waxy基因成熟蛋白的等电点为5.52。氨基酸序列比对的结果表明，黑麦Waxy蛋白1a亚基（AY011009）与本研究中预测的黑麦Waxy蛋白具有高度的同源性，黑麦的Waxy基因和其他植物Waxy基因的比较显示，成熟GBSSI蛋白的相似度比信号肽高（见表2）。我们发现，黑麦和其他作物信号肽区的氨基酸序列一致性为82.9到91.6，成熟GBSSI蛋白区的一致性为95.5到97.4，我们的研究结果表明，信号肽区的氨基酸结构的保守度总体上比成熟蛋白区低，由于信号肽位于蛋白质的氮端，其功能为将蛋白质从合成位点经过相应的膜结构运输到相应的细胞器中（叶绿体，淀粉体等）（Patron and Waller 2007），因此作物A，B，D，H和R基因组Waxy基因编码的蛋白其信号肽的氨基酸序列多样性可以反映出不同基因组的进化，并可用来鉴定或分析作物的基因型。我们的blastn结果表明，成熟的黑麦GBSSI蛋白属于糖基转移酶超家族，它催化糖基从活跃的供体分子转移到特定的受体分子，形成碳水化合物上的糖苷键或其他生物大分子（Breton et al .2006年）。我们预测，黑麦GBSSI的成熟蛋白可分为两部分：氮端非催化结构域（230个氨基酸）和碳端催化结构域（304个氨基酸）。淀粉结构域（SBD）是淀粉的合成或降解必不可少的成分（Machovic and Janecek 2006），内部SBD的重复已经在拟南芥（Zhang et al . 2005），芸豆（Senoura et al . 2007），小麦（Li et al . 2000）的SS基因的非催化区得到鉴定。比较了植物的SSIII 和GBSSI蛋白序列，我们预测在植物GBSSI蛋白的非催化区域可能也存在SBD（图2D），因为对SBD活性（Senoura et al . 2007年）至关重要的两个芳香族氨基酸残基：色氨酸（W, aa 159）和苯丙氨酸（F, aa 216）在GBSSI区域中高度保守。我们将黑麦GBSSI和淀粉合成酶（SS）（Leterrier et al . 2008）的比对结果相比较，发现SS大部分催化域是保守的，例如，所有经鉴定的GBSSI都具有作为ADPG结合位点的基序I（KTGGLG）和作为糖基转移酶结构域的基序（STGGLV），在序列同一性的基础上，我们构建了植物成熟GBSSI蛋白的系统进化树，发现植物Waxy基因可以分为2个聚类，一类包括所有已检测的单子叶植物：黑麦，普通小麦，一粒小麦，拟斯卑尔脱山羊草，A. tauschii，大麦，玉米，水稻 ，高粱（图3）。该聚类可以进一步分为2两组：一组包括玉米，水稻，高粱，第二组包括小麦，一粒小麦，拟斯卑尔脱山羊草，A. tauschii，黑麦和大麦。我们的研究结果表明，黑麦GBSSI蛋白和小麦Wx-7A蛋白具有97.4的序列同源性，而且进化关系密切（图3）。Fig. 2. Characterization of rye and other plant Waxy genes. (A) Schematic diagram of the exonintron organization of the rye Waxy gene. Exons are indicated by black boxes and introns by thick lines. The size (bp) of each exon is indicated below the corresponding box and the locations of PCR primers (see Table 1) are indicated by arrows. (B) Comparison of the coding regions of transit peptides, containing the CAA insertion in three wheat Waxy genes. Identical bases are represented by hyphens. The GBSSI sequences used for this analysis are as follows: S. cereale (this study, FJ491377), T. aestivum (Wx-7A, AB019622; Wx-4A, AB019623; Wx-7D, AB019624), T. monococcum (Wx-TmA, AF110373), A. speltoides (Wx-TsB, AF110374), A. tauschii (Wx-TtD, AF110375), and H. vulgare (barley, X07931). (C) Sequence alignment for the predicted transit peptides from the same sequences in (B). An asterisk indicates identical amino acids in that column,while a colon indicates amino acids of the same type in that column. (D) Sequence alignment for the predicted starch-binding domains from S. cereale GBSSI (this study, FJ491377), T. aestivum GBSSI (Wx-7A; AB019622), H. vulgare GBSSI (X07931), O. sativa GBSSI (X53694),T. aestivum SSIII (AAF87999), P. vulgaris SSIII (AB293998), and A. thaliana SSIII (DQ241810). The numbers indicate the amino acid position of the corresponding protein. An asterisk indicates identical amino acids in that column, a colon indicates amino acids of the same type in that column, and a triangle indicates conserved aromatic residues that are essential for the binding activity of the starch-binding domain.Fig. 3. Phylogenetic tree of mature plant GBSSI