脂环酸芽孢杆菌(_Alicyclobacillus).ppt

脂环酸芽孢杆菌 Alicyclobacillus 的检测与控制 严纪文Jiwen y 概述 脂环酸芽胞杆菌 Alicyclobacillus 是脂环酸芽胞杆菌属 革兰阳性 仅有一株为革兰阴性 的芽胞杆菌 人们根据其耐热 耐酸的特性 俗称为耐热菌 耐热耐酸菌 嗜热耐酸菌 嗜酸耐热菌等 已有文献报导 脂环酸芽胞杆菌是引起果汁 酸性饮料 尤其是巴氏灭菌的果汁 腐败变质的主要元凶 1998年美国国家食品生产者联盟 NFPA 经过调查发现 美国35 的果汁腐败都与嗜酸的芽胞杆菌有关 嗜酸耐热菌的在芽孢可橙汁中萌发 生长 也可以在30 的苹果汁 葡萄汁中生长良好 导致果汁产品腐败的嗜酸耐热菌主要是酸土脂环酸杆菌 引起的果汁腐败变质的主要是它的代谢产物 2000年起 美国及欧洲大部分果汁消费国要求浓缩果汁中脂环酸芽胞杆菌的含量应 1CFU 10mL 2002年起 浓缩果汁中对耐热嗜酸菌的要求为不得检出 脂环酸芽胞杆菌引起腐败的初期不易发现 产品并不出现明显的涨包或酸败 因而在低污染时难以检出 但其代谢产物达到万亿分之一的浓度时 就会使果汁口感风味变劣 浊度升高乃至在包装底部形成白色的沉淀等质量危害 其芽胞还可污染生产中的半成品 浓缩果汁 生产材料 加工水果 生产设备 Walls等人对酸土环脂芽孢杆菌的致病性进行了研究 他们将含有高浓度酸土脂环酸芽孢杆菌的生理盐水悬菌液0 5ml注射到小鼠腹膜内 小鼠未表现出任何异常现象 证明在受试浓度内该菌不具致病性 用含菌5 106CFU ml的苹果汁饲喂豚鼠 一周后豚鼠仍表现正常 至今未见关于饮用了含脂环酸芽孢杆菌的果汁后导致疾病的病例报道 小结 脂环酸芽胞杆菌虽然可引起饮料变质 但目前未发现其对人致病 愈创木酚愈创木酚 又称邻甲氧基苯酚 2 甲氧基苯酚 是用于食品的合成调味料 它可以产生甜 烟熏和烧烤风味 卤酚溴酚 包括2 6 二溴苯酚 2 6 DBP 和2 6 二氯苯酚 2 6 DCP 可产生 药味 消毒水味 脂环酸芽胞杆菌的代谢产物 脂环酸芽胞杆菌的分类与命名 1971年Darland和Brock在美国的酸热环境中分离到芽孢杆菌Bacillusacidocaldarius 该菌细胞膜中具有独特的 环己烷脂肪酸结构和藿烷化合物结构 且这种菌只在酸热的环境中存在 将其命名为酸热脂环芽孢杆菌 不久Hippchen等也在土壤中分离到相似的菌株 1984年Cerny等在腐败的苹果汁中分离到一株细胞膜中含 环己烷脂肪酸结构的芽孢杆菌 高度怀疑该菌导致了苹果汁的腐败 1987年Deinhard等对包括前述菌株的13株耐热耐酸菌做了结构分析和全面的鉴定 将其中一株与B acidocaldarius相似的菌株命名为酸土环脂芽胞杆菌 B acidoterrestris 1992年Wistozkey等对这些菌株进行了16SrDNA序列分析将这三株菌从芽孢杆菌属中划分出来 命名为脂环酸芽孢杆菌属 Alicyclobacillus Churey等人1994年从腐败的苹果汁中发现嗜酸耐热芽胞菌 经鉴定为酸土脂环芽胞杆菌 Splittstoesser等人从腐败的无菌包橙汁中发现2株嗜酸耐热芽胞菌 革兰染色阳性 芽孢耐热性D90 为16 23min D95 为2 4 2 8min 脂环酸芽胞杆菌的模式株 A acidoterrestris酸土环脂芽胞杆菌 1998 2003年 不断有人从南极 亚速尔群岛 日本仙台火山附近的土壤中分离到这类细菌 至此脂环酸芽胞杆菌属有11个种 1个亚种 该菌属新菌种的发现仍在继续 脂环酸芽胞杆菌的生化特性 可生存在高温 高酸的条件下 最适生长温度为42 53 生长pH2 0 6 0 在某些特殊的培养基中不能生长 如 酸土环脂芽胞杆菌不能生长于含胰酪蛋白胨 牛肉汤琼脂的培养基中 甚至pH达到3 5时也无法生长 菌株在培养基中45 需氧培养1 2d即形成明显的菌落 菌落形态一般为圆形饱满 乳白色 半透明或不透明 直径为0 5 5mm 菌体形态为杆状 革兰染色阳性 产芽孢 芽孢呈椭圆形 端生或次端生 有时会使菌体细胞膨大 菌体宽0 35 1 1 m 长2 6 3 m 好气生长 对脂环酸芽胞杆菌的生化鉴定常采用API50CHB鉴定系统 API50CHB鉴定系统采用49种碳源 糖 醇 观察芽胞杆菌对其的利用情况进行编码鉴定 但脂环酸芽胞杆菌的部分菌株之间糖利用情况的差异并不显著 往往需要进一步的鉴定 酸土环脂芽胞杆菌生化反应 目前分离脂环酸芽胞杆菌的常用培养基 BAM BacteriaAcidocaldariusmedium OSA orangeserumagar PDA patatodestroseagar 但需调节pH至3 5 YSG yeaststarchglucose K氏培养基 SK琼脂培养基等 脂环酸芽胞杆菌的生长温度 pH范围 嗜酸耐热菌在不同果汁中的抗热性 研究表明 培养基中的阳离子 Ca Mg2 Ba2 Mn2 Sr2 对嗜酸耐热菌的抗热性无影响 有机酸的不同 苹果酸 柠檬酸 酒石酸 对嗜酸耐热菌的抗热性无显著性影响 在88 91 范围内 当pH值增加约0 6时 D值增加近1倍可溶性固形物的含量会影响嗜酸耐热菌抗热性 在同样温度时 D值随可溶性固形物的增加而增加 但当温度接近97 时 影响不明显 脂环酸芽胞杆菌的分布与污染途径 脂环酸芽孢杆菌通常存在于土壤中 在18 70 生长 pH2 7存活 当pH 4时便生出芽孢成为变异细胞 芽孢的耐热能力为85 56min 90 15min 95 2 4min 通过土壤 灰尘 昆虫等附着在果实表面 此外 该菌也可以通过其特殊的细胞结构黏附在果实表面 脂环酸芽胞杆菌检验方法介绍 原理 样品经热处理 去除样品中的非耐热杂菌 取适量样液用0 45um滤膜过滤后 将滤膜贴于培养基中 培养后进行菌落计数 必要时可于显微镜下检查芽孢 仪器 恒温水浴 80 1 恒温培养箱 40 1 灭菌培养皿 直径为90mm 灭菌试管 18 180mm 滤膜 0 45um水系一次性滤膜 K氏培养基的配制 酵母粉1 25g蛋白胨2 50g葡萄糖0 5g吐温800 5ml琼脂6 50g蒸馏水500ml配制方法 将各成分加入蒸馏水中 溶解后 在121 灭菌15 25min 冷却至约50 时用经过滤除菌的12 5 的苹果酸 1 25g苹果酸加入10ml蒸馏水 溶解后以0 45 m滤膜过滤 调节pH3 7 0 1 倾注平板 平板密封后置0 5 下可保存60d 样品处理 浓缩汁 以无菌操作分别取10ml浓缩汁于二个15ml灭菌的试管中 其中一管插入温度计 温度控制管 将二样品管置80 1 的水浴中 观察温度控制管中温度计的温度 当温度计读数达到80 1 时 开始计时 维持13min 水面应高于试管中的样品 取出后迅速冷却至室温 用90ml的灭菌蒸馏水将热处理过的样品转入灭菌容器中 摇匀 将稀释后的样品溶液用0 45um的滤膜真空过滤 也可根据样品的污染情况 选择合适的稀释度进行过滤 样品处理 清汁 水 分别取150ml清汁 或水 于二个已灭过菌的玻璃样品瓶中 同上操作 样品冷却至室温 用0 45um的滤膜真空过滤 也可根据样品的污染情况 选择合适的稀释度进行过滤 样品处理 浊汁 分别取20ml浊汁于二个已灭过菌的试管中 同上操作 样品冷却至室温 用0 45um的滤膜真空过滤 也可根据样品的污染情况 选择合适的稀释度进行过滤 培养与计数 用灭菌的镊子 将过滤膜从过滤器上取下放在K氏培养基上 保证滤膜与培养基接触 不能留有气泡 倒置于40 41 恒温培养箱中 可在恒温培养箱底部放置一个有水的盘子 以调整恒温培养箱的湿度 培养5d 培养结束后 记录该培养温度下滤膜上的菌落数 报告 CFU 10ml 关于脂环酸芽胞杆菌的检验要点 培养基的pH调节 建议使用苹果酸 浓度可在10 20 之间 据文献报导培养基的pH在3 7 0 1时 耐热菌生长良好 如配制200mlK氏培养基 用0 336g苹果酸即可达到pH3 7 0 1 取样量选择原则 浓缩汁 少取并稀释 成品料 多取 可不稀释或直接过滤 注意样品的代表性 视污染情况而定 培养基的用量 因本实验的培养时间较长 5d 所以每皿培养基的用量应在20ml以上 以避免因培养基水分损失造成细菌不生长 热处理的温度与时间 热处理温度多采用80 1 但也有采用74 76 进行热处理 热处理时间 10 20min都有人选择 选择原则 接近巴氏灭菌的温度与时间 的或产品生产工艺要求的温度与时间 培养时间与温度 培养温度 在40 45 可根据样品中污染情况选择适宜的培养温度 培养时间 多数为5d 也有3 5d 但培养5d更利于芽胞的复苏 菌落的识别 脂环酸芽胞杆菌在K氏培养基上的菌落大多为奶油色 轻微的凸起 不透明 生长速度很快 有时24h即可形成芽胞 必要时可镜检芽胞 芽胞多位于菌体的顶端或中部 注意实验过程的不确定度 在同样的条件 人员 仪器设备 实验室相同 短暂的时间间隔 下 同一个实验样品检测两次的结果的差异应 5 在不同的条件 人员 仪器设备 实验室 时间不同 下 同一个实验样品检测两次的结果应 15 耐热霉菌检验方法介绍 仪器 培养箱 温度设在30 1 水浴锅 温度设在44 46 水浴锅 温度设在80 1 无菌培养皿 150mm 15mm 牛奶稀释瓶封口膜 培养基与试剂 PDA培养基 临用时冷却至46 每100ml培养基中加入经过滤除菌的10 酒石酸1ml 调节pH至3 5 0 1 10 酒石酸的配制 称取10g酒石酸于90ml蒸馏水中溶解后 用0 45um的滤膜真空过滤 于室温保存 MEA培养基 乳酸酚棉蓝染色液 LactophenolCottonBlueStain 无菌水 样品的处理 浊汁及浓缩果汁 以无菌操作 分别取50ml检样于二个无菌稀释瓶中 再添加50ml无菌蒸馏水 其中一检样插入温度计 温度控制管 清汁 以无菌操作 分别直接吸取100ml检样于二个无菌瓶中 其中一检样插入温度计 温度控制管 将上述样品同时放入80 的水浴中 当温度控制瓶的温度达到80 1 时开始计时 维持30min 将出样品瓶放入冰浴中冷却后 吸取样液平均注入到8个无菌培养皿中 每个培养皿注入35 40mlPDA琼脂 同时作空白试验 培养基凝固后 倒转培养皿 放入30 的培养箱内培养14d 培养结束后 计数8个平板上所有的菌落数 结果报告 浊汁及浓缩果汁以cfu 50ml报告 清汁以cfu 100ml报告 关于耐热霉菌的检验要点 计数时应注意剔除细菌 酵母菌落数 霉菌菌落的确认 将可疑菌落以点种的方式分别接种二个MEA平板中 一个置25 培养 一个置37 培养 培养7d 观察菌落的颜色 结构 菌丝体颜色 可溶性色素 如果产生 和分泌物颜色 如果产生 必要时用乳酸酚棉蓝染色液染色镜检 低倍镜下观察菌丝结构 油镜下观察孢子 真菌实验室污染的防护 霉菌孢子容易随空气飘扬 稍一震动就可产生喷发式的扩散 而造成空间的污染 一般要求霉菌 酵母检验应在独立的实验室进行 进行实验时 应尽量保持实验室安静 减少空气流动 观察结果时动作要轻 尤其是提前观察结果时要避免次生菌落的产生 实验后 尤其是大量培养后要做好消毒 除在第一时间将霉菌培养物灭菌外 还要对培养箱 接种箱 实验室进行消毒 霉菌孢子对紫外线抵抗力较强 通常以甲醛熏蒸 严重污染时可用10 甲醛喷雾 有文献推荐 用1 五氯酚钠喷布 可维持十五天药效 保存霉菌菌种时就注意避免交叉污染 对使用的菌株的致病性和产毒能力要有充分的了解 做好相应的个人防护 HACCP与生产现场卫生监控及嗜酸耐热菌的控制 HACCP的概念 HACCP是英语HazardAnalysisandCriticalControlPoints的首字母的缩略词 通常称为 危害分析和关键控制点方法 系统 其基本含义 为防止食物中毒或其他食源性疾病的发生 应对食品生产加工过程中造成食品污染发生或发展的各种危害因素进行系统和全面的分析 在此分析的基础上 确定能有效地预防 减轻或消除各种危害的 关键控制点 进而在 关键控制点 对造成食品污染发生或发展的危害因素进行控制 并同时监测控制效果 随时对控制方法进行校正和补充 HACCP通过这种 分析 控制 监测 校正 的一套连续方法 保证食品的安全卫生 HACCP方法的基本内容 HACCP方法是一套系统方法 由以下各部分连续 有机地组成 危害分析 确定关键控制点 制定控制措施与标准 监测控制效果 控制措施的校正或补充 验证HACCP系统 如何进行危害分析 分析研究既往流行病学资料 大量的食源性疾病的流行病学调查表明 下列因素是造成食品微生物污染发生发展的危害 食品原料 污染食品原料的有害微生物 在整个食品生产过程中都会成为食品 半成品或终产品的污染源 食品加工人员 患有各种感染性病灶的食品生产加工人员 有不良卫生习惯食品生产加工人员 卫生管理不善 工具设备 生产环境等因未清洗或清洗不彻底 也将成为各种微生物的污染源 微生物残留与生长繁殖 生物性污染是具有生命活动的生物体 常常因食品生产加工过程中的适宜条件而不断地生长繁殖或不断代谢产毒 观察食品生产加工现场 进行危害分析时 有必要对产品和加工操作过程进行专门的观察和评价 回答以下问题 关于原料与配方 使用什么原料 或食品终产品含有何种成分 原料表面或原料内部是否可能存在有害微生物 如果有 是什么微生物 如果使用防腐剂 防腐剂浓度是否足以能防止微生物的生长繁殖 产品的pH是否能防止微生物的生长或灭活特定的致病菌 产品的水活度是否能防止微生物的生长 关于食品生产加工方法 在制作 加工或贮藏过程中污染物是否可能接触食品 在烹调 再加热或其他加工过程中 微生物是否能灭活 食品加工后是否有任何微生物污染食品 在制作或贮藏过程中 是否存在微生物生长繁殖的条件 包装或容器如何影响微生物的存活 或生长 食品加工 制作 贮存和销售过程各需多长时间 关于食品食用前的贮藏与再加工方式 食品食用前 是否需要热藏 冷藏 冷冻或在常温下保存 再加热的时间 温度条件是否能灭活微生物或毒素 食品再加热后是高温存放还是在室温下存放 食品在销售或贮藏过程中是否存在其他潜在污染 对食品生产加工过程的卫生状况进行评价 主要是对生产加工设备和用具的消毒 生产加工环境的卫生清洁的效果进行评价 内容包括 观察清洗消毒步骤 测量清洗消毒液的使用温度 测量清洗消毒液中清涤剂和消毒剂的有效浓度 测量清洗消毒液与被清洗消毒物品的接触时间 检查洗消后设备的外观 必要时 应从设备表面用拭子采样或接触采样 进行微生物学检测分析 关于危害分析的几种特殊检测方法 热加工食品的温度测量 食品的贮藏温度与时间测量 温度与时间曲线的绘制与分析 食品pH值的测量 食品水活度 aw 的测定 食品样品的采集与检测分析 食品生产加工环境的采样与分析 微生物学诊断性试验 绘制食品生产流程图 根据观察的食品生产加工过程绘制出食品生产工艺流程图 并将所发现的危害因素 关键控制点 控制标准与监测方法标示在图上 可能性的食品污染 在加热或其他杀灭微生物的加工过程中 可能存活的微生物或微生物毒素 可能生长繁殖的致病性微生物 绘制工艺流程图 原料果验收包装材料验收 原料果清洗 拣果 清洗 破碎榨汁 巴氏消毒 酶解脱胶 超滤 浓缩 巴氏消毒 无菌灌装 贮藏 出厂 运输 果汁调配 脱气 均质 无菌灌装 贴标 入库 PET瓶料 吹瓶 二次灭菌 Y 浊汁 清汁 Y Y Y Y Y Y Y 确定 关键控制点 与控制措施 关键控制点 是食品生产加工过程中能有效地控制各种危害的重要环节 关键控制点 的确定主要取决于 食品生产加工过程中可能存在的危害种类及其严重性和危险性 在加工和制作过程中 产品经过的生产加工过程 食品终产品的食用方式 几类 关键控制点 的确定 原料果及包装材料 辅料验收 原料果 包装材料 辅料可能带有外源性微生物 嗜酸耐热菌 霉菌 酵母等 控制措施 原料果 腐烂率 3 5 酵母 20000CFU g 霉菌 20000CFU g 包装材料 每批材料均需有符合相关标准的证明 辅料 如糖等辅料有供应商的验证证明或第三方检验证明符合卫生标准 原料果拣选 原料果可能引入的酵母 霉菌等微生物 控制措施 每N小时对原料果密度 人员密度 烂果率进行检查 超滤与巴氏消毒 微生物未充分杀灭 控制措施 滤膜质量 更换时间 灭菌温度 时间 果汁调配 调配用水质量 果汁酸度或pH的调整会影响对微生物的杀灭效果 控制措施 糖度和