鸡(Gallus gallus) IFNγ基因重组蛋白.doc

鸡(Gallus gallus) IFN基因重组蛋白复性条件的优化及生物活性鉴定摘要：本文用18种不同的复性缓冲液对表达纯化的cIFN进行复性处理，通过SDS-Page和对鸡胚成纤维细胞和鸡胚的保护实验检测复性产物的得率和生物学活性。研究结果表明：去污剂和疏水剂能保证蛋白的复性得率和复性效率，重组表达产物得率可高达94.7%；氧化还原电势对是cIFN成功复性的关键，有生物学活性的复性产物的复性液中均含有氧化还原对GSSG/GSH；经去污剂处理后再复性的产物对保护细胞的有效浓度显著低于直接复性的蛋白。关键词：鸡重组干扰素；复性条件；生物学活性IFN属于型干扰素，又称免疫干扰素，是在特定诱生剂的作用下由多种细胞产生的具有高度生物活性的可溶性糖蛋白，是一种重要的细胞因子1。IFN在抵抗哺乳类和鸟类病原侵染中具有重要的作用，对肿瘤2、细菌3、病毒4以及寄生虫5等具有多重抵抗作用。目前研究已证实鸡IFN对流感病毒、新城疫病毒6，马立克氏病毒7-9，鸡劳氏肉瘤病毒10等具有较好的抑制作用，它不仅参与机体对病原侵害的保护性应答，还可通过细胞的信号通路广泛参与包括调节机体MHC II成熟、抗原呈递等在内的免疫调节，是机体内重要的免疫增强剂11。鸡的IFN基因由4个外显子和3个内含子组成，其开放性阅读框有495个碱基，编码19个氨基酸的信号肽和145个氨基酸的成熟蛋白，其成熟蛋白大小约为18kDa。本实验室从依莎褐鸡中克隆获得的cIFN (Genbank accession number：AY705909 )，并成功的利用大肠杆菌表达出具有生物活性的鸡IFN12 。但由于鸡IFN在大肠杆菌中高效表达，其表达产物主要以无活性的包涵体形式存在，须对包涵体进行变性、复性等后续处理工作，以获得具有生物学效应的重组表达产物。不同的重组蛋白的复性条件有非常大的差异，复性效率显著不同，这些严重制约鸡IFN的工业化生产。因此，我们对蛋白质复性条件进行优化，力求找到一种简单、价格低廉、复性得率和效率较高的方法，为鸡IFN的工业化生产奠定基础这里能否找到一些文献，说明不同蛋白的复性工艺不同；哪些条件是限制复性效率的，也就是国内外的研究进展，最好能表述一些，放在里面，以增加我们工作的意义。1 材料与方法1.1 鸡重组干扰素（cIFN）蛋白表达产物纯化的鸡重组干扰素由课题组制备加参考文献。1.2 SPF鸡胚SPF鸡胚(北京梅利亚维通实验动物技术有限公司)， 38孵化，控制湿度60%。1.3 鸡新城疫病毒Rubulavirus Newcastle disease virus (NDV)新城疫病毒NDV（CVCC,AV1611），购自国家兽医微生物菌种保藏中心，经SPF鸡胚尿囊接种，增殖一代，毒力为10-6CLD50 /0.10ml。1.4 cIFN复性条件的探索1.4.1 利用缓冲液置换，以PBS进行透析复性将纯化得到的鸡重组干扰素的浓度稀释到100g/ml13，将其全部转移入透析袋后，放在4预冷的透析液-（40mM Tris-Cl，300mM NaCl, Urea浓度分别为6.0M、4.5M和3.5M，调pH=8.0）中透析24h，每种透析液持续透析8h，每4h更换一次。转移5ml至一新透析袋，放入透析液（PBS）中透析24h，间隔4h更换一次透析液，期间用磁力搅拌器温和搅拌。复性完毕，取1ml样品，4,10000g离心取上清液进行考马斯亮蓝蛋白质定量和SDS-PAGE电泳分析。1.4.2 利用不同复性液进行透析复性 参照1.4.1的方法，将纯化得到的鸡重组干扰素中的变性剂浓度透析降低至3.5M后，分别转移至新透析袋放入透析液（相应的复性缓冲液）中透析复性24h。复性完毕，转移至PBS中，透析除去残留的变性剂。取最终复性完成的样本1ml，4,10000g离心取上清液进行考马斯亮蓝蛋白质定量和SDS-PAGE电泳分析。1.4.3去污剂作用效果分析将纯化得到的鸡重组干扰素的浓度稀释到100g/ml，分别将TritonX-100加入到透析液-处理前后的变性蛋白质溶液中，4磁力搅拌器温和搅动4h，再参照1.4.2的方法在复性试液16中进行复性及分析。1.4.4 疏水剂作用效果分析参照1.4.3，将经透析液-处理后加入TritonX-100的鸡重组干扰素所得的样品平均分成五份，向第一、二份样品中加入-CD，温和搅动2h，将第一、三份样品分别放在不添加PEG的复性试液16中进行复性处理，将第二、四份样品分别放在不添加任何疏水剂的复性试液16中进行复性及分析，第五份样本放在复性试液16中进行复性。1.5鸡重组干扰素复性产物的抗病毒活性分析1.5.1 细胞实验分析cIFN复性产物的抗病毒活性 本次实验测定新城疫病毒（NDV）对鸡胚成纤维细胞的毒力（TCID50）为10-6.123/0.1ml 。取9日龄鸡胚制备鸡胚成纤维细胞12，待接种于96孔板的细胞生长致密后，选用在复性试液3、8、11和16中复性完成的蛋白，分别在培养的细胞中加入不同剂量(5、10、20、40、80 、160、320ngml-1) 的cIFN处理24h，然后以100倍TCID50浓度，每孔20ul的NDV感染细胞。同时设置空白对照组（无cIFN和病毒）、阳性对照组（40 ngml-1cIFN）、阴性对照组（10-6浓度NDV），每组各5个平行。病毒感染作用1h后，Hanks缓冲液将各孔病毒洗掉，加入1640培养液培养72h后，于显微镜下观察细胞形态，并以MTT法检测细胞的存活率。1.5.2 鸡胚实验分析cIFN复性产物的抗病毒活性本次实验测定新城疫病毒（NDV）对鸡胚的毒力（EID50）为10-6.079/0.1ml。在进行鸡胚攻毒前，选用在复性试液8和16中复性完成的蛋白使鸡胚建立抗病毒状态，每种蛋白设立0.5、1、2、4、10g/枚五个蛋白组和一个空白对照组，每组10枚，共计12组。24h后接种100EID50的NDV，逐日观察鸡胚死亡情况至孵出。1.5.3 去污剂及疏水剂对cIFN复性产物的抗病毒活性的影响参照1.5.1制备鸡胚成纤维细胞，选用1.4.3中复性的两份蛋白、1.4.4中复性的第一、三、五份蛋白，分别设置1、5、10、20、40、80 、160 ngml-1七个实验组保护细胞，同时设置空白对照组、阳性对照组和阴性对照组，处理24h后以100倍TCID50浓度，每孔与上面的重复么？在上述抗病毒活性检测中，直接把不同的复性组合放入应当就可以了20ul的NDV感染细胞，感染后培养72h，用MTT法检测细胞的存活率。表一：18种蛋白质复性缓冲液配制表复性试液编号缓冲液Tris-Cl pHmM离子浓度NaClmM变性剂UreaM助溶剂L-Arg 蔗糖mM去污剂TritonX Tween%疏水剂-CD PEGmM-巯 甘氨基乙醇 酸mM谷胱甘肽GSH GSSGmM1408.03001.80001400010002406.41501.80010040000.520.23406.41501.8400400014004000020.24408.03001.8400400100010.5005406.43001.8040010000020.26408.01501.804000140040010.5007408.01501.8400010040010008406.43001.8400001400000.520.29406.43001.8040010400400100010408.01501.80400010000.520.211408.01501.840001040000020.212406.43001.8400001040010.50013408.03001.8000104000020.214406.41501.80010400010.50015406.41501.84004000100100016408.03001.84004001040040000.520.217407.21371.80000000020.218407.213700000000020.22 结果2.1 利用不同复性液对鸡重组干扰素复性条件的摸索纯化的鸡重组干扰素经18种不同的复性试液透析后，均得到不同程度的复性。其中复性试液3、8、11和16在透析复性的过程中，几乎没有产生肉眼可见的沉淀，其复性产物的得率最高，复性完成后经考马斯亮蓝定量分析发现，16后复性试液中复性的cIFN得率可达83.7%。复性试液5、7、17和18中cIFN的得率最低，在复性后期出现大量白色沉淀，其中18号复性试液组分相当于生理盐溶液，在其中复性的cIFN几乎全部沉淀析出。将复性试液中的不同成分及复性得率做logistic-regression分析表明，复性试液中助溶剂、去污剂、疏水剂以及谷胱甘肽的作用最为显著。助溶剂在蛋白复性过程中可以通过破坏错误折叠中间体的稳定性，从而达到提高蛋白的可溶性的目的，L-精氨酸和蔗糖都是常用助溶剂，在本实验中，前者的助溶效果优于后者。在cIFN复性过程中去污剂TritonX-100的效用优于Tween-20，在复性试液其他成分不变时，添加TritonX-100的蛋白得率为83.7%，明显高于Tween-20的最高得率64.3%。选择在复性开始前后分别往变性蛋白质溶液中加入去污剂，对蛋白的复性得率没有显著影响。疏水剂可以阻止蛋白质分子间相互碰撞，减少蛋白质的聚集沉淀，PEG与-CD是最常用的蛋白质修饰剂，本实验中两者单独使用的效用没有显著差异，两者共用，协同作用显著，拥有最高的蛋白得率。实验发现，谷胱甘肽是cIFN复性的关键因素，在蛋白得率排名前四的复性试液中均存在谷胱甘肽，最高得率为83.7%；而不含谷胱甘肽的复性试液最后的蛋白得率不超过四成（见表一、图一）。图一：SDS-Page分析18种复性缓冲液复性产物选择在变性的cIFN中的变性剂浓度为8M和4M左右时，向溶液中引入去污剂，对蛋白质得率没有显著影响，但前者的复性产物的抗病毒活性优于后者。复性试液组分中是否带有疏水剂，能显著影响复性产物的得率，实验发现，变性的cIFN中是否含有疏水剂对产物得率没有显著影响，但若复性试液中不含有疏水剂，80%以上的cIFN将沉淀析出。2.2鸡重组干扰素复性产物的抗病毒活性分析2.2.1 cIFN复性产物对鸡胚成纤维细胞(CEF)抗病毒活性的影响 复性产物cIFN对CEF细胞抗NDV保护作用的实验结果表明，在四种复性液中复性的40 ngml-1以上的cIFN对侵入NDV的CEF均具有明显的免疫保护作用(p0.05)；复性试液16中复性的蛋白在10 ngml-1时便能保护CEF抵御病毒的入侵，随着浓度的升高这里最好放一些照片，细胞形态的照片，加强效果，其保护能力迅速提升，当浓度达到160 ngml-1时，其保护的CEF几乎不受病毒侵袭；8号复性试液中复性的cIFN的抗病毒活性相对较弱，当浓度达到320 ngml-1时，其保护作用仍未达到最优。各阴性对照组中细胞的存活率和空白对照组相当，说明在离体状态下各复性试液复性的蛋白对CEF细胞没有毒害作用。显微观察结果显示，病毒对照组的细胞大量变圆脱落，并伴随细胞融合现象，其OD值在各组中均是最低。2.2.2 cIFN复性产物对鸡胚抗病毒活性的影响 以鸡胚的存活率对攻毒后的存活时间作曲线，分析发现，攻毒后48h，两个空白组的鸡胚全部死亡，而在两种复性试液中复性的不同浓度的cIFN均表现出一定的保护鸡胚抵御NDV的能力。在复性试液8复性的蛋白组中，攻毒后72h给与0.5、1和2g蛋白组的鸡胚存活率均降至50%以下，120h后2g蛋白组的鸡胚存活率仅为20%，其余两组鸡胚的死亡率为100%；4g与10g蛋白组在攻毒后72h的鸡胚存活率均为80%，120h后仍均有60%的鸡胚存活直至孵出。在复性试液16中复性的cIFN表现出相对较高的防护能力，攻毒72后仅0.5g蛋白组的鸡胚存活率降至10%，其余各蛋白组鸡胚的存活率均在60%以上；120h后0.5g蛋白组鸡胚全部死亡，1g和2g蛋白组的鸡胚存活率分别为10%和50%；4g与10g蛋白组鸡胚的最终孵出率分别达到70%和90%。 2.2.3 去污剂及疏水剂对cIFN复性产物保护鸡胚成纤维细胞(CEF)抗病毒活性的影响 本实验所采用的五种cIFN的复性方法对其产物高浓度下的生物学活性没有显著影响。实验发现，变性蛋白样品中引入去污剂TritonX-100的时间点能显著影响蛋白的复性效率，选择在复性开始前用TritonX-100处理的复性产物的生物学活性在1ng.ml-1时就具有对CEF的保护能力，其存活细胞的OD值显著高于NDV对照组（P0.05），当蛋白浓度达到5 ng.ml-1以上时，两者保护的细胞的存活率均显著高于各自的阴性对照组。在变性蛋白质中引入疏水剂，能改善cIFN的复性效率，实验结果显示，在变性蛋白样品中引入-CD的复性产物，低浓度下对CEF的保护能力明显优于不添加疏水剂的复性产物。复性试液中同时引入疏水剂有助于cIFN的复性，能有效提高其复兴效率，数据显示，样本中添加疏水剂与否，在完整的16号复性试液中复性的产物的生物学活性均优于不完整的（剔除PEG）复性试液16的复性产物。3 讨论 在大肠杆菌中许多外源蛋白的高水平表达最后都会形成包涵体，包涵体具有无定形、呈非水溶性、只溶于尿素等变性剂和不具有相应的生物学活性等缺点。想要进行蛋白的相关功能研究和获得具有生物学活性的蛋白必须对包涵体进行复性。透析除去变性剂是最常用和最廉价的蛋白复性方法，尤其适用于较大规模的工业化生产，然而这种方法亦有其弊端，经其复性后正确折叠的蛋白质的产量不稳定，有时会很降低，更有些蛋白尤其是含有多对二硫键的蛋白质基本上不能正确进行折叠。因此，探索一种能使鸡干扰素稳定高效复性的方法，是其当前面向市场和进行工业化生产的关键。本研究在获得高效表达的cIFN基础上，通过对其本身性质、蛋白质浓度、复性液的pH值、变性剂的起始浓度和去除速度、助溶剂、疏水剂、离子强度、去污剂和氧化还原电势等进行了分析，并进行了大量复性条件的摸索和优化，发现在cIFN复性过程中，助溶剂、去污剂、疏水剂以及氧化还原电势的效用最为显著，其中助溶剂和疏水剂是保证复性得率的关键，而去污剂和氧化还原电势直接关系到蛋白的复性效率。同时研究发现，复性前利用去污剂预先处理变性蛋白质能显著提升复性效率，复性效率与蛋白质的纯度呈正相关，在变性蛋白质中引入去污剂，有利于进一步除去蛋白中残留的宿主菌成分，后续的活性实验证明，在相同的复性条件下，用去污剂预先处理的复性产物的有效浓度相对较低。在复性过程中，引入氧化还原电势是鸡干扰素成功复性的基础，变性蛋白质复性中常常存在二硫键搭配错误的问题，导致蛋白质的聚集沉淀14，氧化还原对GSSG-GSH可以纠正搭配错误的二硫键并催化其在正确位置上的形成，实验证明，8种不含有谷胱甘肽的复性试液复性的蛋白均不具有保护细胞抵御病毒的能力。透析复性是经典的蛋白复性方法，具有批处理量大、操作简单、成本低廉等优势，易于考察影响复性效率的诸因素，可以方便得出较优的复性条件。本研究通过对鸡干扰素复性条件进行优化，成功找到了一种复性得率和复兴效率均较高的复性方法，并通过鸡胚成纤维细胞和鸡胚实验验证其具有较高的生物学活性，证明了鸡干扰素在病毒病的防治方面的广阔的应用前景，为新型抗病毒制剂的研制和干扰素的大批量生产奠定了基础。 1 Isaacs A，Lindenmann J. Virus interference：the interferonJ. Proc Rsoc Lond Eer B，1957，147：258-267.2 Ringenbach L，Bohbot A，Tiberghien P，et al. Polyethylenimine-mediated transfection of human monocytes with the IFN-g gene：an approach for cancer adoptive immunotherapyJ. Gene Ther，1998，5：1 508-1 516. 3 Sawai N，Kita M，Kodama T，et al. Role of gamma interferon in Helicobacter pylori-induced gastric inflammatory responses in a mouse model J. Infect Immun，1999，67：279-285. 4 Fiorelli V，Barillari G，Toschi E，et al. IFN-g induces endothelial cells to proliferate and to invade the extracellular matrix in response to the HIV-1 Tat protein：implications for AIDS-Kaposis sarcoma pathogenesisJ. J Immunol，1999，162：1 165-1 170. 5 Luty AJ，Lell B，Schmidt-Ott R，et al. Interferon-gamma responses are associated with resistance to reinfection with Plasmodium falciparum in young African childrenJ. J Infect Dis，1999，179：980-988.6Yeh HY，Winshow BJ，Junker DE，et al. In vitro effects of recombinant chicken interferon gamma cells. 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