打靶载体构建.doc

基因敲除小鼠的构建 利用同源重组技术进行打靶载体的构建利用同源重组技术进行打靶载体的构建 孔 冬 小鼠遗传学实验室 南京大学模式动物研究所 基本原理基本原理 传统意义上的打靶载体的构建受基因组 DNA 上限制性内切酶位点的强烈局限 考虑到后期利用 Southern 杂交进行阳性克隆筛选时的内切酶是否可以区分重组和 野生型染色体 同时顾及同源臂两端的内切酶是否能与常用载体的多克隆位点相匹 配 最后可供我们进行选择的打靶区域往往非常有限 而近年来发展起来的基于噬 菌体的大肠杆菌同源重组系统为我们摆脱这种束缚提供了一个有效的平台 高效 省时 灵活是该系统的三大特点 2004 年底小鼠 129 品系 BAC 文库末端测序的完 成更为这一技术的应用提供了巨大的便利 大肠杆菌中同源重组的研究由来已久 其原理如图 1 所示 而 Neal G Copeland Nancy A Jenkins 以及 Donald L Court 实验室所采用的 噬菌体 RED 系统较之前代 又有以下优势 高效 所需 同源序列由 500bp 降至 45bp 低突变率 为使此系 统能便利的应用于条件性基 因敲除打靶载体的构建 他 们建立了两个大肠杆菌菌株 EL250 EL350 三个质粒 pL253 pL451 pL452 图谱见附录 两个菌株 中的 gam 基因以及 RED 重 组酶基因 exo 和 bet 均受温 度敏感性 抑制子 cI857 的严格调控 抑制子在 32 处于活化状态 而其在 42 的短暂失活能使其控制的基因迅速表达 此外 EL250 中的 Flpe 及 EL350 中的 Cre 重组酶基因则受阿拉伯糖诱导的 PBAD启动子的 调控 在阿拉伯糖的参与下进行表达 这两个菌株可以有效地去除 loxP 或 FRT 重 组位点间的 NEO 筛选框 质粒 pL253 pL451 pL452 均来源于 pBlue Script 载体 分别用于打靶载体的骨架 loxP FRT NEO FRT 或 loxP NEO loxP 片段的 PCR 扩增 利用此系统构建条件性打靶载体的基本步骤如图 2 所示 图图 1 基因敲除小鼠的构建 自 Sanger 研究所定购的 129 BAC 克隆被装入 DH108 菌株以琼脂为载体进行 邮寄 为使后续操作易于进行 我们首先从 100 200 Kb 的 BAC 中将包含左右同 源臂的目的片段 约 10 20Kb 套取下来 见图 3 A pL253 载体中的两段同 源序列各长 500bp 是以 129 基因组 DNA 为模板 用 PCR 的方法获得 经内切酶 消化后连接克隆入 pL253 载体 利用介于两段同源序列之间的线性化位点进行线 性化的 pL253 载体在 EL350 中与 BAC 发生同源重组 阳性克隆可用氨苄青霉素筛 选获得 插入 loxP 位点的原理如图 3 B 所示 包含两段各长 80bp 同源序列的 loxP NEO Kan loxP 片段同样以 PCR 制备 所不同的是该同源序列包含在 PCR 的引物 进行合成 同源重组后的质粒同时具有氨苄青霉素和卡那霉素抗性 重新将质粒抽 提物转入 EL350 中可以去除菌株中其它未发生重组的质粒 加入阿拉伯糖后 Cre 重组酶的表达可以将 loxP 位点间的 NEO 剪切掉 从而只留下一个 loxP 同样道理 我们可以在 EL250 中插入第二个 loxP FRT NEO Kan FRT 留在载体中可用于 ES 细胞的筛选 最终的载体用测序的方法进行验证 图图 2 基因敲除小鼠的构建 图图 3 实验技术实验技术 以下以基因 MLCK myosin light chain kinase 为例 其载体构建过程如图 4E 所 示 129 小鼠品系 BAC 克隆的查询及订购 1 前往 www ensembl org 点击 Mouse 如箭头所示 2 在 Search 框内寻找目的基因 例如 p53 基因敲除小鼠的构建 3 在检索结果中选则所要的项 4 点击 View gene in genomic location 后面的链接 5 滚动页面到图示位置 点击 DAS Source 选择 129S7 AB2 2 clones 和 BAC ends 选项 6 点击 close menu 等待页面刷新 滚动页面到图示位置 绿色和红色 代表在克隆内不同的方向 的线条都代表包含 Trp53 的 BAC 克隆 左边线条下是克隆号 7 任选一个克隆比如 bMQ358p19 点击克隆号出现下拉菜单 点击 DAS LINK bMQ358p09 基因敲除小鼠的构建 8 滚动页面到图示位置 点击 MTA required 箭头所示处 9 从 Sanger 定购 BAC 需完成两部分表格 1 网上电子表格 2 MTA 表格 此表格需传真并邮寄原样 登陆 http www ensembl org Mus musculus 网站查询目的基因 BAC 的抽提及纯化 试剂 SolutionSolution I I Tris HCl0 05 M EDTA 0 01 M pH 8 0 SolutionSolution IIII SDS1 NaOH0 2 M SolutionSolution IIIIII KAc5 M pH 5 5 步骤 1 搜集细菌 9000 rpm 离心 10 分钟 倒掉上清 2 加入 5ml 预冷的 Solution I 及 20ul 25mg ml RNaseA 重悬 3 加入 5ml SolutionII 上下颠倒 5 10 次 室温放置 10 分钟 4 加入 5ml 预冷的 SolutionIII 上下颠倒 5 10 次 冰放置 10 分钟 5 10 000 rpm 离心 10 分钟 收集上清到新离心管 如仍有白色沉淀物悬浮 重复离心一次 6 加入 12ml 异丙醇 振荡器混匀 7 10 000 rpm 离心 10 分钟 倒掉上清 留下白色 DNA 沉淀 8 重悬入 500 ul SolutionI 加等体积 1 1 酚氯仿 振荡器混匀 基因敲除小鼠的构建 9 12 000 rpm 离心 5 分钟 将上层吸入新的 1 5 ml 离心管中 注意不要吸 入白色沉淀 10 加 50ul 3M NaAc pH 5 2 以及 350 ul 异丙醇 混匀并在 12 000 rpm 离 心 10 分钟 11 倒掉上清 加入 500ul 70 乙醇 12 000 rpm 离心 5 分钟 12 倒掉上清 将 DNA 沉淀在空气中凉干 13 用 100 ul MilliQ 水溶解 DNA 电转感受态细菌的制备及 BAC 电转 1 接种单克隆 EL350 EL250 至 3 ml LB 培养基中 32 240 rpm 培养 12 16 小时 2 第二天 将过夜菌液 1ml 接种到 50ml LB 培养基 32 240rpm 培养 2 3 小时至 OD600 0 5 0 7 3 如只转 BAC 而不进行同源重组 此步省略 将 10ml 菌液分装 到 200ml 锥形瓶 置于 42 水浴摇床中 约 40rpm 保温 15 分钟 4 将锥形瓶置于冰上 20 分钟 此间将 pH7 4 MilliQ 水 以及电 转杯 离心管置于冰上预冷 5 于 4 离心机 3 500 rpm 离心 5 分钟将菌液沉淀 6 以 1ml 冰水将菌体轻轻重悬 3 500 rpm 离心 5 分钟 倒掉 上清 7 重复步骤 6 三次 8 倒掉上清 余下约 50ul 用以悬浮菌体 9 将此感受态细菌与 100 400 ng DNA 必须溶于 MilliQ 混合 并转入预冷的 0 1cM 电转杯中 置于冰上准备转化 10 设置 BIORAD 电转仪 1 75KV 25uF 200 进行电转 11 电击后 迅速加入 500 ul SOC 并于 32 保温 30 分钟 12 将菌液均匀的涂在相应的 LB 琼脂板上 于 32 保温 12 20 小时 PCR 引物设计及 PCR 纯化 MI L 5 GCGGCCGCTGTCCCTACTCCTAATTTGTCC 3 MI R 5 AAGCTTAGTGTGTTGGGGACATGGCT 3 MII L 5 AAGCTTGCAAACCTCAGACATCAGGG 3 MII R 5 ACTAGTGGGAAGCACCTGAAATCTGG 3 基因敲除小鼠的构建 Ploxp L 5 TGAAGTACCCAAGGACTACAAGAAAGGTTCA TGAGGAAATAAATGGCTGGCAGTCACTGGTAAGAGGAGA GTTTGAAGGTGAATTCCTGCAGCCCAATTCCGATC 3 Ploxp R 5 CTGACTGGAAAAGGAGCCAGATACATATTGG CAAGCTCTGGTCTCCTCAGCCCAGCCTCCTGACTCCTCCA CCATGTCTGGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCTCG 3 Pfrt L 5 AGCAGTCTGCTAGCCTTGGGACCCCTGTACCCACT GTCCTCCTGACTTCTTGTCTAATCTTATCTTTTTAACATATA AATTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCC 3 Pfrt R 5 CCCCATGATTTGCCTCTAGTAGTGTAGAAACAGGA AAGATGAATGAATGGATGGGAGTAAGACCATTTTCTGTTT TCTTATCGCTCTAGAACTAGTGGATCCACCTAATAACTTC 3 其中 MI M II 两对引物用于扩增两段各长 500bp 同源序列 I 和 II PCR 产物与 T 载体连接 然后分别用 Not I Hind III 和 HindIII SpeI 将片段 I 和 II 切下来 同时连入 Not I Spe I 酶切过的 PL253 载体 这样就构建好了用于套取目的片段的载体 I II PL253 其中 Hind III 将用于该载体线性化 PLoxp 这对引物用于扩增两端各长 80bp 同源序列的 loxP NEO Kan loxP 片段 而引物 Pfrt 用来扩增两端各长 80bp 同源序列 的 FRT NEO Kan FRT 片段 以上 PCR 产物以及酶切片段均用 QIAquick Gel Extrcction Kit 纯 化 套取 BAC 中的目的片段 将转入 BAC 的 EL350 制备成电转感受态 同时将线性化的载体 I II PL253 转入 其中 100 200ng 50 ul 感受态菌 电转后的菌用 Amp 的 LB 板筛选 其中 发生准确交换而形成的质粒 MLCK PL253 的酶切图谱如图 4A 所示 插入loxP NEO Kan loxP 片段 将上述含有 MLCK PL253 的 EL350 制备成电转感受态 并将纯化的 loxP NEO Kan loxP 片段转入其中 100 200ng 50 ul 感受态菌 电转后用 Amp Kan 的 LB 板筛选 为了得到插入 loxP NEO Kan loxP 片段的纯的质粒 MLCK PL253 基因敲除小鼠的构建 1stLoxp 我们还需将上面筛选得到的质粒重新转入 EL350 中 并用 Amp Kan 筛选 质粒 MLCK PL253 1stLoxp 的酶切图谱如图 4B 所示 Cre 介导的 loxP 位点间 NEO 片段的去除 1 将含有 loxP NEO Kan loxP 质粒的 EL350 克隆接种到 3ml LB 培养基 Amp Kan 中 32 240rpm 培养 12 16 小时 2 第二天 将 1ml 过夜菌液转入 10ml LB 32 培养 2 3 小 时至 OD600 0 5 3 加入 100ul 10 L 阿拉伯糖 继续培养 1 小时 4 将菌液稀释后分别涂在氨苄青霉素和卡那霉素 LB 琼脂板上 32 培养过夜 5 氨苄青霉素板上的克隆应远远多于卡那霉素板 在前者上挑取 几个克隆培养并用 PCR 酶切或测序方法进行验证 其中 NEO 去除后的质粒 MLCK PL253 1stLoxP pop out 的酶切图谱如 图 4C 所示 插入FRT NEO Kan FRT片段 将质粒 MLCK PL253 1stLoxp pop out 转入 EL250 并制备成电转感 受态 同时将纯化的片段 FRT NEO Kan FRT 转入其中 100 200ng 50 ul 感受态菌 电转后的菌用 Amp Kan 进行筛选 得到的质粒再转入 EL250 通过 Amp Kan 筛选得到纯的目的载体 插入该片段的质粒 MLCK PL253 1stLoxP 2ndLoxP 的酶切图谱如图 4D 所示 目的载体经过测序 确认正确后就可用于 ES 细胞的电转 图图 4 基因敲除小鼠的构建 A MLCK PL253 酶切图谱 lane 1 HindIII lane 2 EcoRI B MLCK PL253 1stLoxP 酶切图谱 lane 2 HindIII lane 3 EcoRI C MLCK PL253 1stLoxP pot out 酶切图谱 lane 2 HindIII lane 3 EcoRI D MLCK PL253 1stLoxP 2ndLoxP 酶切图谱 lane 2 HindIII lane 3 EcoRI E MLCK 打靶载体构建过程 M 代表 Marker EcoR 14 digest 实验试剂及耗材实验试剂及耗材 参考文献参考文献 1 Lee E C et al A highly efficient Escherichia coli based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA Genomics 73 56 65 2001 2 Ellis H M Yu D DiTizio T Court D L High efficiency mutagenesis repair and engineering of chromosomal DNA using single stranded oligonucleotides Proc 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