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专题综述作物育种信息第 11期总第175期 2008年11月29主办单位：四川省农作物育种攻关办公室四川省科技厅农村科技处主 编：蔡 红副主编：郑林用 雷 波本期责任编辑：谢国禄编辑出版：四川省农科院信息所作物育种信息编辑部地 址：成都市净居寺路20号邮 编：610066电 话：（028）84504194E-mail：要 目 常用DNA 标记的评述及在花生上的应用 不同甜高粱种质的SSR多态性分析 利用分子标记鉴定玉米籽粒中控制类胡萝素含量的两个主要位点 将玉米线粒体DNA插入核中产生广泛的插入位点变异 在育种群体育成的小麦近等基因系中镶孢菌穗疫病抗性Fhb1 QTL的确认 温敏雄性不育两系水稻杂种产量和产量构成的配合力和杂种优势 陆地棉种质中的肾形肾脏线虫抗性 欧洲小麦条锈菌幼苗和成株抗性资源研究 拜耳作物科学在印度启动其全球第一个抗白叶枯病的杂交水稻品种 跨国公司和正在崛起的中国种子帝国2523127目 录 科技纵横【专题综述】常用DNA 标记的评述及在花生上的应用1【前沿科技】源于EST的微卫星作为燕麦分子标记的富集资源5CP基因遗传转化甘蔗品种Badila与福农91-4621的抗病性差异分析5不同甜高粱种质的SSR多态性分析6甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆6几丁质酶和-1,3- 葡聚糖酶基因导入甘蔗7大豆高蛋白基因分子标记及其在大豆育种中的应用7普通菜豆抗炭疽病基因的分子标记与定位研究8崖城系列甘蔗亲本遗传多样性的AFLP标记分析8应用AFLP技术分析甘蔗引进品种的遗传多样性9发芽玉米中的D4;1 和D5细胞周期素蛋白：相关激酶活性和植物激素调控9利用CAPS TAO1902诊断控制番茄维管束萎蔫菌2号小种抗性的I-2基因10利用分子标记鉴定玉米籽粒中控制类胡萝素含量的两个主要位点10在斑豆蚕豆杂交中ICA Bunsi蚕豆衍生的白霉菌抗性的QTL分析10将玉米线粒体DNA插入核中产生广泛的插入位点变异11在育种群体育成的小麦近等基因系中镰孢菌穗疫病抗性Fhb1 QTL的确认11采用无凝胶PCR-ELISA对含有小麦黑麦易位的小麦基因型进行分子鉴定11【技术与方法】回交育种分析花生脂肪酸含量的变化12温敏雄性不育两系水稻杂种产量和产量构成的 配合力和杂种优势12在Arina 和NK93604杂交衍生的六倍体小麦群体中控制镰孢菌穗疫病抗性和低含量脱氧瓜萎镰菌醇的数量性状位点12陆地棉种质中的肾形肾脏线虫抗性13日本梨树和榅桲树早期花序发育的比较13种植杂交玉米4轮时玉米根区的植物有益微生物的富集及其多样性13向日葵黑茎病部分抗性的遗传分析14大麦水涝耐性的配合力14强化玉米营养的番茄红素环化酶的自然遗传变异14利用联合收割机上近红外线光谱法评价油菜品质15A3 CMS在甜高粱育种中的可行性研究15矮杆和半矮杆大豆突变体植株生长对外源GA3的响应15不同高油花生品种(系)油分积累特性的模拟研究16菜豆炭疽菌生理小种鉴定及普通菜豆种质的抗性评价16大豆生物量积累、收获指数及产量间的相关与QTL 分析17大豆重组自交系Jinf F10抗大豆孢囊线虫4号生理小种抗性的分析研究17栽培高粱、甜高粱和拟高粱前中期染色体DAPI显带核型18大豆菌核病拮抗菌株的筛选18【材料与品种】牛尾草地方群体和品种表型变异利用野生资源改良品种的潜力19欧洲小麦条锈菌幼苗和成株抗性资源研究19拜耳作物科学在印度启动其全球第一个抗白叶枯病的杂交水稻品种19大豆疫霉根腐病3号生理小种20菜豆种质资源对枯萎病菌的抗性研究20甘蔗栽培原种对蔗茅柄锈菌的抗性鉴定21值得在旱地蔗区推广的甘蔗优良新品种21能源用甜高粱杂交种辽甜3号选育21野生花生种质的SSR遗传多样性22中国花生核心种质的建立及与ICRISAT 花生微核心种质的比较22【科技纵横】20 多粒花生沉睡2100 年23温室栽培中早熟温州蜜柑的产量和影响产量波动的因素24跨国公司和正在崛起的中国种子帝国24高度表达合成Bacillus thuringiensis cry1A转基因的大豆特性25甘露糖对甘蔗外植体再生的影响25大豆雄性不育及杂种优势利用研究进展26甲醇和抗坏血酸对蚕豆生长及丙二醛含量的影响26再论中国粒用高粱育种方向与策略26专题综述常用DNA 标记的评述及在花生上的应用花生是世界性的油料与经济作物，是一种重要的植物性食用油和蛋白质来源，具有较高的经济价值。基于花生在国民经济和人民生活中所占的重要地位，其遗传育种研究一直受到广泛重视。由于花生染色体小、数目多，依靠形态标记、细胞学标记和生化标记建立遗传图谱难度很大。DNA分子标记的兴起为花生研究注入了活力，它对花生新品种保护、良种保纯、杂种鉴定、种质资源研究、基因定位和标记辅助育种均具有重要意义。相比其它遗传标记，分子标记具有以下突出优点：(1)不受环境条件的影响，直接以遗传物质DNA的形式表现；(2)遍布整个基因组；(3)多态性高；(4)表现为“中性”，不影响目标性状的表达；(5)可鉴别纯合与杂合基因型，提供较完整的遗传信息；(6)分子标记可提前选择，加速了育种进程。因此，分子标记一经出现，就被广泛用于植物遗传图谱的构建、基因定位、系统发育关系的分析、种质资源分类鉴定以及辅助选择育种等方面。本文就分子标记在花生研究上的应用作一简要综述。一、DNA 分子标记类型遗传研究中使用的分子标记很多，目前应用在花生种质资源及辅助育种的分子标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP 和TRAP 等技术。1. 限制性片段长度多态性(RFLP) 产生RFLP (restriction fragmentlength polymor-phism) 的分子基础是DNA 中特定的限制性酶切位点上碱基对的改变及酶切位点之间的分子重排事件(如缺失、易位、倒位等)。用特定的限制性内切酶消化后，不同遗传组成个体间的DNA可产生大小不同的片段。通过与克隆的特定DNA片段(探针)杂交和放射自显影等步骤可以检测到RFLP的存在。该标记实验结果稳定可靠，在遗传上呈共显性。缺点是所需DNA量较大(510g), 实验操作复杂，且探针具有种属特异性, 目前尚难在育种中广泛应用。2. 随机扩增多态性DNA (RAPD) RAPD(random amplified polymorphic DNA) 以人工合成的随机寡聚核苷序列为引物，以基因组总DNA为模板，利用PCR技术随机扩增得到一系列的多态性DNA片段，通过凝胶电泳将长短不同的DNA片段分开。其操作简便快速，所需DNA 量少(1525ng)。缺点是扩增产物易受反应条件的影响，实验结果重复性较差，而且一般在遗传上呈显性。3. 扩增片段长度多态性(RFLP) 这是以PCR 为基础的RFLP (amplified fragmentle-ngth polymorphism)技术。基因组DNA 经两个限制性内切酶酶切后，与特定接头相连接，然后用已标记的专用引物选择性地扩增限制性酶切片段，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测DNA多态性。AFLP兼具RAPD和RFLP的优点，快速高效，且结果稳定可靠，重复性好。目前，该技术受专利保护，成本较高。4. 单核苷酸多态性标记(SNP ) 人类群体有很大的遗传多样性，在大多数基因位点上都会有若干个等位型；对每一个核苷酸来说，其突变率大约为10-9 左右，这就意味着，每一个核苷酸在任何一代人群中大约每109个个体就会发生一次变异。由这种方式产生的单碱基变异就形成许多双等位型标记SNP (single nucleotide polymorphism)，这种标记在人类基因组中可达到300万个，平均约每1 000个碱基对就会有一个。因此，34个相邻的这种标记构成的单倍型(haplotype)就会有816种，相当于一个微卫星标记形成的多态性。但是由于这种标记数目多，覆盖密度大，因而在基因定位的研究中就有着其它标记系统不可比拟的优越性和潜力。这种标记的开发和应用摒弃了遗传标记分析技术的“瓶颈”凝胶电泳，为DNA 芯片技术应用于遗传作图提供了基础。5. 微卫星DNA (SSR) 真核生物的基因组中存在许多串联短的DNA重复序列，它分布于整个基因组的不同位置上，其重复长度有高度的变异性，但微卫星DNA两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术，可扩增两个位点之间的微卫星DNA序列，然后用电泳分析核心序列的长度多态性。SSR (simple sequence repeats)标记的多态性丰富，重复性好，遗传上呈共显性。此外，植物中常用的分子标记还有ISH (in situ DNA hybridization, DNA原位杂交)、STS (sequence tagged site, 序列标签位点)、SCAR (sequence characterized amplified region, 序列特异扩增区域)等。6. 目标区域扩增多态性(TRAP) 这是一种新的基于PCR的植物基因型标记技术，具有简单、稳定、效率高的特点。借助日益增长的庞大的生物序列信息，TRAP (target region amplification polymorphism)利用生物信息工具和EST 数据库信息，产生目标候选基因区多态性标记。TRAP 技术采用两个18核苷酸引物产生标记。一个为固定引物，依据EST序列设计；另一个为随机引物，针对外显子和内含子的特点，设计为分别富含GC或AT核心区的任意序列。通过对目标区域PCR扩增，产生围绕目标候选基因序列的多态性标记。作为一种新型的植物基因分型技术，TRAP不但有RAPD技术易于操作的特点，还有AFLP技术强大功能的优势，这将使它在种质资源的基因鉴定和作物的理想农艺性状基因标记上很有帮助。二、分子标记在花生上的应用研究花生DNA 分子标记研究始于RFLP 和RAPD研究，近年来SSR、AFLP 等标记技术逐步得以应用。1. 花生属内种质进化研究 花生属的起源和进化已有许多学者从形态学、细胞学等方面进行了广泛深入的研究，初步明确了一些种的进化。分子标记技术的产生和发展为花生种质进化研究又增添了一项新的手段。花生属在植物分类学上分为9个亚属，共有69个经过描述的种。唐荣华等(2004)选出16个可在多粒型花生品种DNA 中扩增出多态性片段的SSR 引物，每个SSR引物能扩增出17个DNA 片段，在24个花生品种中能扩增出123 条多态性片段。根据SSR分子标记计算出品种间遗传距离0.090.82，平均为0.59。聚类分析结果说明所分析的24个花生种质可分为不同的品种群。Dwivedi 等(2001)用RAPD技术在26 个花生品种中筛选出8个引物，其遗传相似性由59.0%到98.8%，平均为86.2%。贺梁琼等(2005)对44份材料进行SSR分析，40 对SSR引物中有3对引物能在部分杂交后代中稳定的扩增出野生亲本的特异谱带，表明这些材料整合了野生亲本的遗传物质。2. 研究花生的遗传多样性 对花生育种工作者而言，种质资源的遗传多样性及其亲缘关系信息是至关重要的，这是育种工作的基础。利用分子标记技术对骨干品种进行分类研究，通过聚类分析，估算遗传距离，建立树状图，对研究种质资源多样性，指导科学地配置杂交组合具有重要的作用。He 等(1996，2005)通过DAF和AFLP技术对花生栽培种作DNA标记多态性鉴定。在559个DAF引物中有17个检出多态性，其中15个引物为UBC10聚体引物，平均每个基因型的每个引物产生近18条带，其中3.7 条具多态性。64 对AFLP 引物中有28 对可检测出DNA 多态性，总共检测出111个多态性位点，每对引物平均检测出57.8 条带，每对引物有3.96条带具多态性。Hopkins 等(1999)以标记的串联重复序列为探针筛选花生基因组DNA文库，获得多态性SSR引物6个；SSR 引物在栽培花生中揭示的多态性高，19 份被鉴定的栽培花生种质出现17条特征基因型。叶冰莹等(1999)用RAPD技术分析了12个花生品种的遗传多样性，从80个随机引物中筛选出20个进行扩增，共扩增出132 条具有多态性的条带。韩柱强等(2003)利用11 对SSR 引物对24个栽培花生种(包括4大类型)进行PCR 扩增分析，其中4 对检测到明显的多态性。根据扩增结果可以将21个品种相互区分。姜慧芳和任小平(2002)利用RAPD 技术对7个不同植物学类型的花生种质资源进行了分析，在所用的83个随机引物中，13个引物的扩增产物显示出不同品种间的多态性，15.7%的引物能显示花生品种间DNA 多态性；这13 个引物共扩增出26条具多态性的片段。陈强等(2003)对32个来源于中国不同产地的花生品种进行了AFLP指纹图谱及相似性聚类分析，结果表明，所有供试花生品种的遗传相似性为35%，在45%的相似性水平上分为3个群，表明中国花生品种存在遗传多态性。 3. 花生分子标记图谱构建 利用花生品种间的DNA 多态性，构建分子标记图谱，可为生产上品种真实性和纯度鉴定以及品种知识产权的保护，在分子水平上提供依据。李双铃等(2006)在对10个花生品种的AFLP 分析中，利用Mse和EcoR酶切和9对引物组合共扩增产生169条带，其中55条为多态性的，其多态性带比率为32.54%。Herselman (2003)对21个花生栽培品种进行了AFLP分析，EcoR/Mse和64对引物组合共扩增出2053 条带，其中63条为多态性带；而Mlu/Mse和16对引物组合扩增出1188 条带，其中27条为多态性带。因此，用AFLP技术进行品种鉴定和指纹图谱绘制时应选择扩增谱带多态性强，数目多的引物组合。翁跃进等(1999)利用AFLP 技术对9份花生抗旱品种绘制指纹图谱，通过引物E-ACA和与相应的M-CAG 和M-CAT，在3006 000 bp的范围内共获得1577 条AFLP扩增产物，每个品种有主带和次带至少71条之多，其中10条为多态性的带纹。Cacia 等(1996)利用A.stenospermaA.car-denasii 的杂交后代与A.stenosperma 回交群体构建了基于RAPD的基因图谱，并将与对线虫抗性有关的RAPD 标记绘于图谱上。Halward 等(1993; 1994)利用二倍体野生种种间杂交(A.stenospermaA.cardenasii)后代群体，构建出花生的RFLP 图谱，定位了分布在11个连锁群上的117个RFLP 标记，其中编码脂肪生物合成酶的基因的3个cDNA 克隆已被定位在图谱上。4. 分子标记辅助育种 选择是育种中最重要的环节之一。传统的基于表型的选择方法存在许多缺点，效率较低。分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可能。利用与目标性状紧密连锁的分子标记可在生育早期阶段进行选择，从而大大提高育种效率，加快育种进程。吴兰荣等(2003)利用花生野生种A.cardenasii 与铁岭四粒红杂交，并以染色体加倍获得栽野杂种后代，经多代自交选择，获得具有早熟、抗病、农艺性状较好的新种质材料8126。应用RAPD分子标记技术鉴定8126，从76个引物中筛选出3个特异引物OPE2、OPF8、OPF20，能在8126中稳定地扩增出野生亲本的特异谱带，表明8126整合了野生亲本的遗传物质。RAPD特异谱带可以作为8126中野生亲本A.cardenasii 的特异遗传标记。5. 花生根瘤菌研究 分子标记技术在花生根瘤菌的分类和多态性研究中得到广泛应用。Van-Rossum (1995)结合RAPD分析结果对17个Bradyrhizobium sp 和1个Azorhizobium菌株作了比较。研究表明17个Bradyrhizobium菌株仅有2个rDNA 同源组，与Rhodopseud-omonas palustris、Nitrobacter sp、Afipia sp 和Blastobacter denitrificans 相似性很高，而与- Proteobacteria和Rhizobiaceae 相似性较低。杨江科等(2002)对花生根瘤菌的系统发育和遗传多样性进行了RAPD 和RFLP 研究分析；研究表明花生根瘤菌的遗传多样性及其在系统发育中的地位主要受地域因素的影响，即总体上从平原腹地到外缘地区，根瘤菌地理分隔作用逐渐明显，并且根瘤菌的多样性最为丰富出现在平原外缘的交接地带。Urtz 和Elkan (1996)研究了与花生共生的Bradyrhizobium 的遗传多样性；用RFLP 分析发现来自南非的分离菌变异性丰富，其中一些分离菌nif 和nod 基因RFLP 图谱相似，表明其共生基因具有一定相关性。RFLP 和DNA 同源分析结果说明，花生根瘤菌具丰富的遗传多样性，但16SrRNA 基因测序结果则表现出多样性不明显。陈强等(1999，2003a)对21 株慢生型花生根瘤菌和6 株参比菌进行了16S rDNA PCR-RFLP 分析；结果证实了慢生型花生根瘤菌同慢生型大豆根瘤菌高度的遗传相似性外，还发现一些菌株同有较高的遗传相似性，证明中国的花生根瘤菌之间具有种水平的多样性。6. 研究花生青枯菌 花生青枯病抗性在遗传上受寡基因控制，如珍珠豆型花生的抗性受2 对主效基因控制，花生青枯病简单抗性遗传基础为分子标记的建立和基因的克隆提供了可能。Liao 等(1998)研究证明花生对青枯菌潜伏侵染反应特性存在遗传分化。2000 年起中国与国际半干旱研究所合作开展了花生青枯病抗性的分子标记及辅助选择技术研究，发现了不同花生抗病基因型间的AFLP 和SSR 多态性，建立了青枯病抗性的重组近交系(RI)群体。Taghvi 等(1994) 根据16个菌株16SrRNA 序列分析数据得到两组特异PCR 引物。一组可分离属于RFLP Division(生物型3、4)的青枯菌；一组可分离RFLP Divisison(生物型1、2、N2)的青枯菌菌株。Seal 和Mehan (1994) 通过P.solanacearum16S rRNA 序列分析和基因组减法实验，分析出花生青枯菌特异性DNA 序列，据此设计PCR 引物，建立了迅速鉴定生物型3、4 或5 的PCR 方法。姜惠芳等(2003)以抗青枯病品种“9102”与感病品种“中花5号”杂交，构建了青枯病抗性重组近交系群体(RILs)，用164 对SSR 引物鉴定亲本DNA 多态性及其最佳反应体系和反应条件，获得能检测RIU 群体多态性的引物11 对及其最佳反应体系和反应条件。7. 花生线虫病研究 标记辅助选择(MAS)是在花生栽培种中找到对线虫抗性的一种办法。郑经武和李德葆(1998)用RAPD 技术筛选出具北方根结线虫鉴定特征的特异性扩增条带，经克隆测序，设计了特异引物。通过PCR 可将北方根结线虫幼虫DNA 鉴定出来。Cacia等(1996)从高抗品系GA6 中鉴定出与抗线虫有关的RAPD 标记。该标记定位于回交图谱上A.cardenasii种质渗入区，可将其转换为SCAR 标记。Burow 等(1996)利用抗线虫野生种A.batizocoi、A.cardenasii、A.diogoi 与栽培种杂交育成品系TAG-7，从而构成了BC4F2 抗性分离群体，并采用BSA 法获得了3个与抗线虫有关的RAPD标记。8. 花生抗黄曲霉研究 花生对黄曲霉菌侵染的抗性是以种皮的特殊生化成分及种皮的完整性抵御黄曲霉菌的侵染与定殖，从而减低或避免花生中的黄曲霉毒素污染。培育和利用抗黄曲霉的花生品种是控制毒素污染最理想的途径，分子标记在这个过程中起到了积极作用。雷永等(2005)利用抗、感黄曲霉侵染的花生品种为亲本配制杂交组合“中花5 号J11”，以其F2 分离群体为研究材料，采用AFLP技术和BSA分析方法，获得了与花生黄曲霉菌侵染抗性连锁的2个分子标记，标记与抗性间的遗传距离分别为8.8 cM 和6.6 cM；利用获得的分子标记对抗、感黄曲霉的花生种质资源进行了分子鉴定，结果表明分子标记与抗性鉴定结果具有较高的一致性，证实了两标记应用于研究群体之外的育种潜力。该抗侵染分子标记的建立为开展花生抗黄曲霉侵染辅助选择育种提供了有效的筛选技术，该技术较Rania等(2001)的方法更优。三、展望从国际范围看，花生DNA 分子标记的研究明显落后于其他作物，在国内有关研究也刚刚起步。花生栽培种形态学性状变异丰富，而DNA 多态性贫乏。其原因可能是有限数目主基因和若干修饰基因改变导致形态学性状改变，DNA 水平差异大的不常见，而碱基替换作用通过RFLP、RAPD 不易检出所致。研究发现，SSR 较RFLP、RAPD 可揭示出更丰富的多态性，应在图谱构建中加以利用。但目前开发的SSR 引物还很少，且尚未定位，难以满足花生遗传育种上的需求。设计、开发大量多态性好的分子标记相当必要。随着分子标记技术的日益完善, 将分子标记和其他遗传标记以及传统育种相结合，我们将发现和利用越来越多蕴藏于花生种质资源中的遗传多样性。可以相信，在结构和功能基因组以及生物信息学迅猛发展的背景下, 分子标记技术必将在花生遗传改良和育种研究中发挥越来越重要的作用。（分子植物育种2008 年第1 期，刘 峰等）前沿科技源于EST的微卫星作为燕麦分子标记的富集资源因为基于PCR的微卫星标记具有其显性遗传的特点和适用于高通量分析，所以它是一种有价值的分子育种工具。因为在燕麦中的数量有限，所以要显著增加其数量来覆盖整个基因组。因此，对7031个近来发表的EST进行了筛选。接着的芯片分析建立了AME（源于燕麦EST的微卫星位点）的216对引物。采用一组12个燕麦品系作样本，分析表明195个功能引物中107个具有多态性。标记变异为平均每个位点3个等位基因且多态信息含量值为0.42，该变异说明它们适合燕麦分子育种的目的。有51个AME位点位于已知的KanotaOgle参考图谱中，该图谱以前仅含12个微卫星位点。因此，可以显著提高燕麦图谱微卫星位点总数量。向 平摘译自 Plant Breeding 126（3）：274-278，2007CP基因遗传转化甘蔗品种Badila与福农91-4621的抗病性差异分析植物病毒主要依赖于寄主自身复制转录体系完成繁殖和侵染,故干扰病毒的复制和转录即能延迟或减轻病毒病害。 自1986年,美国Beachy研究小组首次将烟草花叶病毒( tabaco mosaic virus, TMV)的外壳蛋白基因转入烟草获得抗病毒植株以来,植物抗病毒基因工程技术发展迅速。外壳蛋白( coat protein, CP)是目前研究得最为透彻的病毒蛋白之一,除了把病毒RNA包装成病毒粒子起保护作用外,还具有影响病毒系统侵染、蚜传活动、病毒在细胞间的运动及症状诱导等功能。 Potyvirus属CP的N端变异很大,即使同一个病毒的分离物在长度和组成上变化也很大,对病毒的运动起辅助作用,因为N-末端发生突变后使病毒的细胞间扩展变慢。在蚜传的病毒CP蛋白N端存在一个特殊保守基序DAG(Asp-Ala-Gly) , DAG的突变能产生非蚜传株系。大部分有关丧失全部或部分蚜传能力的研究表明,蚜传能力丧失与病毒外壳蛋白变化有关,其主要原因是DAG区域突变后CP无法与HC-Pro结合。甘蔗花叶病是一种重要的世界性病害。在我国,甘蔗花叶病在果蔗上的发生率达80% 100%,在黑皮果蔗Badila上的发生率可达100%。果蔗感染花叶病后,种茎发芽率下降10.6%35.3% ,蔗茎产量下降2.5%33.5% ,蔗糖分下降6% 14%。几个被认为对花叶病有较强抗性的品种如福农91-4621、福农95-1702在最近几年也较大面积发生,严重影响商品价值。国内外研究证明,培育抗病品种是最经济、有效的防治办法。由于甘蔗是高度杂合的无性繁殖作物,遗传背景非常复杂,其抗病性是受微效多基因控制的数量性状,抗病育种群体分离十分广泛,使得通过常规育种手段很难将抗病性状与优良品质性状结合起来。植物基因工程为抗病毒育种开辟了新途径。本研究利用含甘蔗花叶病病毒E株系外壳蛋白基因(CP)的质粒pUbi-SCMV-CP,用基因枪轰击法遗传转化不同甘蔗品种,所获得的转基因无性系经过3代的抗病性鉴定和H2O2 代谢的分析。结果表明,Badila (TB1 )转基因植株具有较强的抗花叶病能力,而福农91-4621在转基因无性系T1、T2 中表现出较强的抗病性,但在T3 中其抗病性开始退化,发病率高达68%；抗病生理分析表明,转基因无性系的抗病性与H2O2 清除和积累有关。经RT-PCR克隆和测序分析,福农91-4621所感染的SrMV-H的CP基因氨基酸序列与转化的SCMV-E的同源性较低,仅为73.2% ,福建Badila所感染的是SCMV-D,与SCMV-E同源性高达97.8%。说明CP基因对本身所来源的病毒或与原病毒亲缘关系较近的病毒可能具有较强的抗性,而对同属于SCMV的其他病毒虽有抗性,但抗性较弱,且随着转基因世代数的增加而降低。（福建农林大学学报(自然科学版) 2008年第1期）不同甜高粱种质的SSR 多态性分析SSR(简单重复序列)又称微卫星(Microsatellite) , 是指基因组中由26 个碱基组成的基本序列串联重复组成的短片段, 如(GA) n、(AC) n 等。同一类微卫星DNA 可分布在整个基因组不同位置上, 其重复次数不同或重复程度不完全, 形成每个座位的多态性。由于SSR 位点两侧单拷贝序列的保守性较强, 因而可以根据其设计1 对特异引物来扩增每个位点的SSR, 扩增产物可以利用电泳分离来检测位点的多态性。SSR 标记技术因具有多态性高、共显性遗传和对DNA 质量要求不高等特点而被广泛应用于遗传多样性分析、基因定位、构建遗传连锁图谱、作物品种鉴别等各个领域。本文通过SSR 分子标记对我国及引自国外的部分甜高粱种质资源的亲缘关系进行深入系统研究, 以避免品种选育中亲本选配的盲目性, 为杂交育种的亲本选配提供依据。利用SSR 标记研究了32份甜高粱种质的遗传变异, 从30对SSR引物中筛选出11对扩增产物是具有稳定多态性的引物。11对引物在供试材料中共扩增出112 条带, 其中多态性带91条, 多态性达81.3%,每对引物扩增出516条, 平均10.2个, 每个位点的多态性信息量(PIC)变化在0.4290.926之间, 平均为0.708。32 份甜高粱种质间的遗传相似系数变化范围为0.5830.969, 平均值为0.724, 揭示出这32 份种质的遗传基础相对比较狭窄。UPGMA 聚类分析结果表明, 32 份供试材料在遗传相似系数0.730 处被划分为三大类, HL1 和HL2 的亲缘关系最近, SART 和L-32 的亲缘关系最远。（中国糖料008年第3 期）甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆蔗糖合成酶是促使蔗糖进入各种代谢途径的关键酶之一,在植物生长发育过程中,具有举足轻重的作用。1955年, Cardini等首次在小麦胚芽中发现蔗糖合成酶；不断深入的研究证明该酶是由分子量(Mr )约为83103 100 103 的亚基构成的四聚体 ,并以两种以上的同工酶形式存在于植物组织中,是蔗糖代谢关键酶中极其重要的一种酶。该酶在果实食用品质、纤维品质以及作物产量调控方面具有重要的意义。目前,研究者已经成功地从马铃薯、玉米、甜菜、胡萝卜和甘蔗等作物中将甘蔗蔗糖合成酶基因克隆出来了。蔗糖合成酶具有影响库强、调控输入蔗糖多少和代谢蔗糖的能力,参与细胞分化与纤维细胞壁合成,调节淀粉合成以及提高植物抗逆性等各种生物学功能。近年来,对蔗糖合成酶的研究主要集中在编码该酶的基因克隆和阐明翻译后的调节机制 ,在转录水平上尚未研究.。本课题组以甘蔗为材料, 研究甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆,拟在转录水平上阐明甘蔗蔗糖合成酶的表达调控机制,最终提高甘蔗含糖量。以甘蔗基因组DNA为模板,用PCR技术分段扩增并克隆了甘蔗蔗糖合成酶( Sucrose synthase)基因片段,并进行序列测序,结果表明该基因全长约为7.5 kb,与Lingle S. E等报道的甘蔗蔗糖合成酶(SuSy2)基因序列相似性达到99.5%，推导的氨基酸序列同源性达到100%。该序列包含约1.9 kb的上游启动子调控区域, 16个外显子, 15个内含子, 3不翻译区等；开放读码框(ORF)编码802个氨基酸,氨基酸序列中存在糖代谢关键酶家族保守的14-3-3蛋白磷酸化位点Ser/Thr。这为进一步在转录水平上阐明蔗糖合成酶的表达调控机制奠定了基础。（应用与环境生物学报2008年第2期)几丁质酶和-1,3- 葡聚糖酶基因导入甘蔗几丁质(chitin)和-1,3- 葡聚糖(-1,3-glucan)是绝大多数真菌(包括甘蔗黑穗病病原菌)细胞壁的主要成分。几丁质酶(chitinase, Chi) 和-1,3- 葡聚糖酶(-1,3-glucanase, Glu) 分别催化几丁质和-1,3- 葡聚糖的水解反应，因而能够通过降解病原真菌的细胞壁，而抑制病原真菌孢子的萌发和菌丝的生长，从而可有效地抑制真菌的繁殖和生长。因此把几丁质酶、-1,3- 葡聚糖酶基因共转入高产高糖甘蔗品种中使其有效的表达，能有效地提高甘蔗对黑穗病的抗性。通过转几丁质酶基因和(或)和-1,3- 葡聚糖酶基因而提高植物的抗病性已在油菜、烟草、水稻及大麦等不同作物上取得了良好的结果，但在甘蔗上还未见报道。本实验将从烟草中克隆的去除液胞定位信号肽序列的烟草类几丁质酶基因和类-1,3- 葡聚糖酶基因串联在一起导入甘蔗基因组中，并对转基因甘蔗植株进行了黑穗病抗性的初步鉴定，以期从分子育种角度探讨培育抗黑穗病甘蔗新品种的可能性。将含有经过修饰的烟草(Nicotiana tabacum L.)类几丁质酶基因和类-1,3- 葡聚糖酶基因的双价植物表达载体pCG-在农杆菌介导下转化甘蔗优良品种ROC10 和ROC22，获得了转化植株52株，经PCR 检测33 株呈阳性；对部分经PCR 检测呈阳性的转化植株进行Southern 杂交和黑穗病抗病性的体外抑菌实验，结果显示这两个基因均已整合到部分甘蔗的基因组中，且它们对甘蔗黑穗病的抗性均有不同程度的提高。（分子植物育种2008年第2期）大豆高蛋白基因分子标记及其在大豆育种中的应用蛋白质含量是大豆的重要品质性状,是微效多基因控制的数量性状,对大豆高蛋白基因进行QTL定位,其目的就是尽可能地发掘有价值的分子标记,利用分子标记在性状选择与鉴定方面的高效性和准确性,辅助选择出高蛋白含量的大豆材料,从而将分子标记辅助选择应用于育种实践,以培育出优质大豆新品种。本研究:选用高蛋白大豆黑农35和高油大豆黑农45作为亲本杂交获得F2分离群体,进行大豆高蛋白基因SSR分子标记。共筛选覆盖大豆全基因组的251对SSR引物,其中40对SSR引物在亲本间具有多态性,用这40对SSR引物分别对F2分离群体进行扩增,用Mapmaker Exp3.0和MapmakerQTL1.1软件进行作图和定位分析。定位得到高蛋白QTL 1个,与satt532连锁,遗传距离为0.2 cM,贡献率为32.7% ,位于大豆公共遗传图谱的D1aQ连锁群。利用该引物在不同大豆材料中进行高蛋白材料检测和筛选,在56 份高蛋白材料中筛选到47 份,检出率达到83.93%。说明引物satt532具有一定的检测通用性,可以利用它筛选高蛋白大豆材料。（大豆科学2008年第2期）普通菜豆抗炭疽病基因的分子标记与定位研究 菜豆炭疽病是危害菜豆生产的主要病害之一，在世界各地均有发生。栽培和利用抗病品种是防治菜豆炭疽病最经济、有效、环保的措施。但由于菜豆炭疽菌的高度变异性，菜豆炭疽菌新小种不断出现，抗病品种的抗性很容易丧失，因此必须不断发掘新的抗病基因。同时在选育抗病品种时，必须首先弄清楚当地菜豆炭疽菌生理小种的分布、变异情况并据此制定相应的育种策略。本研究旨在从我国的抗病地方品种中发掘新的抗炭疽病基因，为抗炭疽病育种奠定基础。本文通过人工接种法鉴定了15个菜豆炭疽菌菌株并对181份地方品种进行了炭疽病抗性鉴定；用菜豆朊蛋白 SDS-PAGE 电泳分析了54份抗病地方品种的基因库来源；用分离群体分组分析法(BSA)和微卫星标记多态性分析对红花芸豆京豆、红芸豆京豆、红芸豆Michelite 3个杂交组合的 F2群体进行了分析，取得如下结果：1. 初步明确了当前中国菜豆炭疽菌生理小种的发生和分布情况。对来源于黑龙江、吉林、内蒙古、河北、云南等8个省 (市) 的15个菜豆炭疽菌菌株进行生理小种鉴定, 共鉴别出5个菜豆炭疽菌生理小种，其中81号小种出现的频率高达67，是中国的优势小种。2. 对181份普通菜豆地方品种进行了抗性评价。用81号小种对181份普通菜豆进行接种鉴定，发现高抗材料2份，抗病材料43份，高感材料33份, 说明我国菜豆资源对炭疽菌 81号小种抗感差异显著，抗病资源丰富。3. 分析了54份抗病地方品种的基因库来源。54份抗炭疽病地方品种中，28份来源于安第斯基因库，26份来源于中美基因库。抗病亲本红花芸豆和红芸豆都来源于安第斯基因库。4. 红花芸豆和红芸豆对菜豆炭疽菌81号小种的抗性均由一显性单基因控制，将红花芸豆中的抗炭疽病基因暂命名为 Co-F2533。5. 微卫星标记多态性分析与遗传连锁性分析发现，位于菜豆B6连锁群上的四个标记Clon1429、BM170、BMD37、Clon410 与红花芸豆中的一个主效抗病基因Co-F2533具有连锁性，遗传距离分别为18.4cM、6.6cM、20.9cM、30.9cM，标记与目的基因在染色体上的位置关系为Clon1429-Co-F2533-BM170-BMD37- Clon410。6. 由于菜豆B6连锁群上至今没有发现抗炭疽病基因，因此Co-F2533是一个新的抗病基因。(2008年中国农业科学院学位论文)崖城系列甘蔗亲本遗传多样性的AFLP标记分析亲本是培育甘蔗优良品种的物质基础，是决定甘蔗选育种水平的关键因素。亲本创新是甘蔗杂交育种工作的重要组成部分，也是甘蔗育种可持续发展的动力源泉。据统计中国大陆自育的品种中，有50%含有创新亲本的血缘，近年来常用的293 份亲本中自育亲本有220 份，占亲本总数的75%，其中崖城系列有85 份，占自育亲本的39%。可见，崖城系列在创新亲本中占有举足轻重的地位，其质量和数量直接影响我国甘蔗育种效率。因此，对这些亲本材料的全面研究显得十分重要。过去曾经对这些材料的血缘代数、开花特性、农艺性状和抗病性等进行过分析研究。由于条件所限，从DNA 分子水平的研究一直无法进行；随着分子技术的发展和实验手段的不断提高，这方面的工作目前正在逐步展开。本文主要报道应用AFLP标记技术对崖城系列部分常用甘蔗亲本材料进行遗传组成分析，从分子水平上揭示其亲缘关系以及遗传多样性状况。采用15对多态性较好的AFLP引物对52份崖城系列甘蔗亲本品系的遗传多样性进行分析，结果表明，每对引物的多态性位点平均为61.40，多态性位点率为77.30%。52份材料的遗传相似系数在0.48320.9614之间，平均为0.6806，遗传多样性属中等水平。来自同一组合“ CP72-1210崖城82-108”品系的遗传相似性系数很高，在0.78360.8398范围内，平均是0.8117。以遗传相似系数阈值约为0.670 0 划分，聚类分析把52份材料分为5大类，系谱记录中亲缘关系密切的品系，大多数都能归为同一类。不同年代品系的遗传多样性指数差异明显，最高是20世纪90年代，为0.3155，最低是20世纪的5070年代，为0.2654；来自同一组合的后代品系遗传多样性指数较低。建议在亲本创新过程中，同一亲本不宜过多重复使用。（分子植物育种2008年第3期）应用AFLP技术分析甘蔗引进品种的遗传多样性亲本是培育甘蔗优良品种的物质基础，是决定甘蔗杂交育种水平的关键因素。我国的甘蔗亲本体系主要是通过引进与创新相结合的方法建立起来的。据有关资料报道，目前我国大陆自育的175个甘蔗生产品种均含有国外品种血缘，其中直接利用国外引进品种作为亲本的育成品种有116个。可见，国外引进品种在我国甘蔗杂交育种中起着十分重要的作用。而过去对引进品种的亲缘关系及遗传多样性的了解主要是依靠系谱图进行分析推断。但有关研究表明，有些系谱记录未能真实反映其亲缘关系。目前，应用DNA分子标记技术研究甘蔗亲缘关系、遗传多样性已较普遍，且在国内外有不少报道，但针对引进品种的利用研究尚未见报道。本研究采用15对多态性较好的AFLP引物对36个甘蔗引进品种的遗传多样性进行分析，结果表明，每对引物的多态性条带数为45.9条、多态率为61.50%，遗传相似系数在0.65780.8762之间、平均为0.7459。聚类分析结果表明，36个引进品种为同一大类，而当地亲本材料粤农73-204独立成另一大类，说明粤农73-204与引进品种之间的亲缘关系较远；36个引进品种可进一步分为3类，相同系列的品种大多数能归为同一类，可见相同区域、相同机构选育的品种亲缘关系相对较近。而在系谱中亲缘关系密切的品种、大部分能归为同一类。遗传多样性指数分析结果显示，36个引进品种的遗传多样性指数为0.2470。本文指出加强引进品种的研究利用是促进我国甘蔗育种发展、有效提高甘蔗品种遗传多样性的重要措施。（广东农业科学2008年第4 期）发芽玉米中的D4;1 和D5细胞周期素蛋白：相关激酶活性和植物激素调控之前我们报道过玉米种子萌发期间的4种玉米细胞周期素（cyclin），并且表明，细胞激动素和生长素对每种cyclin表达的刺激方式各不相同。本文中，我们描述了其中两种cyclin （CycD5 和CycD4;1）蛋白质表达水平下这些激素的作用方式。与对照相比较，CycD5;2（抗体很可能也能识别D5;1）和CycD4;1下降，抗体水平提高。Western印迹分析表明，玉米种子萌发期，BA和吲哚3乙酸（IAA）都不会刺激cyclin积聚。但是，在萌发早期，植物激素，特别是IAA会改变D cyclins 相关激酶的活性。与D cyclins相关的激酶呈Cdk-A型，这是因为这种蛋白质与D cyclins形成免疫沉淀；同时，细胞周期素依赖性激酶抑制剂olomoucine会强烈抑制激酶活性，与玉米kip有关的蛋白（KRP）的羧基端相应的一种肽也会抑制激酶活性。因此，在种子萌发期间，尽管植物激素可能刺激促进cyclin-Cdk 复合物中蛋白激酶活化的信号级联，但是，mRNA和这些玉米D cyclins的蛋白表达没有关系。邱敦莲摘译自Physiologia plantarum，132（1）：7988，2008利用CAPS TAO1902诊断控制番茄维管束萎蔫菌2号小种抗性的I-2基因在世界范围内的番茄产区都存在维管束萎蔫菌，它能引起番茄产量损失。与抗性连锁的分子标记将有利于番茄育种计划。因此，建立一个CAPS标记TAO1902，用之鉴定含有I-2基因的番茄基因型，该基因控制维管束萎蔫菌2号种子抗性。RsaI或FokI限制片断分别与I-2基因的存在或不存在相一致。TAO1902有助于选择抗维管束萎蔫病的番茄种质。向 平摘译自 Plant Breeding 126（3）：331-333，2007利用分子标记鉴定玉米籽粒中控制类胡萝素含量的两个主要位点玉米是-胡萝卜素、胡萝卜素、-隐黄质等维生素A原的重要来源，也是包括氯原酸、玉米黄质等在内的非维生素A原类胡萝卜素的重要来源。本研究中，利用由By804 和B73杂交后代的233个衍生系组成的重组自交（RI）群体检测了玉米籽粒中这些重要的营养组成的数量性状位点（QTL）。连续两年利用高效液相色谱仪测定了单个类胡萝卜素的含量。利用201个分子标记构建了遗传连锁图。分别在1、3、5、6、7、8、10染色体上检测到31个假定的QTL，其中，有23个是单个胡萝卜素的QTL，有8个是总类胡萝卜素的QTL。本研究值得注意的是类胡萝卜的表型变异大多可以从分子水平上根据两个位点(y1，y9)和阐述这些化合物间相互关系的类胡萝卜素QTL得到解释。鉴定到与主效QTL紧密连锁的侯选基因八氢番茄红素合成酶 1 (psy1)的靶向标记（Y1ssr），而主效QTL解释了类胡萝卜素6.6-27.2%的表型变异。这种方法对加快高含量的胡萝卜素玉米籽粒的育种可能会非常有用。可以对这种功能已经清楚的基因(psy1)进行开发利用，进一步开发玉米籽粒中类胡萝卜素的功能标记。y9位点的QTL簇也可以用来聚合控制玉米种质中类胡萝卜素含量的有利等位基因。邱敦莲摘译自Theoretical and Applied Genetics，116（2）：223233，2008在斑豆蚕豆杂交中ICA Bunsi蚕豆衍生的白霉菌抗性的QTL分析由于遗传力较低，所以在干豆（Phaseolus vulgaris L.）中进行白霉菌Sclerotinia sclerotiorum (Lib)de Bary遗传抗性育种是较困难的。为了简化育种，研究者已设法鉴定了支撑白霉菌遗传抗性的QTL。我们在斑豆蚕豆（Aztec/ND88-106-04）重组自交系（85RILs）群体中鉴定到2个控制白霉菌抗性的QTL；而这种抗性衍生于蚕豆地方种ICA Bunsi。ND88-106-04是1个对白霉菌具有抗性的蚕豆育成品系，其抗性来源于ICA Bunsi蚕豆。Aztec斑豆是敏感的。该QTL位于核心图的连锁群B2和B3中。B2 QTL在4个田间环境中的3个环境中得到了表达，这阐明了病害严重度等级表型变异的24.7、9.0和8.7%。B3 QTL在4个田间环境中的2个环境中得到了表达，这阐明了表型变异的15.7和5.3%。B2 QTL以前在ICA Bu