克隆土壤宏基因组.doc

克隆土壤宏基因组：一个访问未培养微生物的遗传和功能多样性战略米歇尔河Rondon1，保罗R8月2日，艾伦D.贝特曼1，肖恩楼布雷迪3特鲁迪H.格罗斯曼2，马克R.离子亲石元素1，卡拉答洛亚科诺2，伯克利A.林奇2，伊恩A.麦克尼尔2查尔斯小调2，彩丽张晓卿22，迈克尔吉尔曼玛西娅与Osburne2，乔恩Clardy3，乔Handelsman1，*，罗伯特古德曼1+作者背景植物病理学系，威斯康星大学麦迪逊分校，威斯康星州麦迪逊大学1;ARIAD制药公司，剑桥，马萨诸塞州2;化学及化学生物学系，康奈尔大学，纽约3摘要在微生物分子生态学的研究进展表明，传统的养殖方法失败代表在自然界中微生物多样性的范围，因为只有一个可行的微生物样本中的一小部分是由栽培技术恢复。发展的方法来研究微生物多样性的充分程度，我们用细菌人工染色体（BAC）载体，构建直接从土壤中分离出（称为宏基因组库）的基因组DNA库。到今天为止，我们已经建成了两个这样的图书馆，其中包含超过100英镑的DNA。16S rRNA基因库之一，从恢复序列的系统发育分析表明，BAC文库包含了微生物门类品种繁多，包括从不同的类群，如低- G + C的革兰氏阳性序列DNAAcidobacterium，Cytophagales的，变形杆菌。大肠杆菌库中的初步筛选，确定了几个克隆，表达外源基因插入，确认BAC载体可用于维护，表达，分析环境的DNA。这些克隆所表达的表型，包括抗菌，脂肪酶，淀粉酶，核酸，和溶血性活动。宏基因组库是一个探索土壤微生物多样性，落后的土壤中的微生物的遗传信息提供访问的强大工具。这些图书馆将是新举措的基础上，进行基因组研究，链接的由难治种植的微生物为主的环境有关的微生物的进化和功能信息。生物圈主要是由微生物（32），但大多数微生物在自然界尚未研究。传统培养微生物的方法，限制那些生长在实验室条件下（14，25）的分析。最近激增的微生物分子生态学的研究提供了令人信服的证据表明存在着许多新的类型的微生物在环境中的数量和品种较少的微生物实验室培养（适合侏儒7，13，31）。从DNA的复杂性和发现许多独特的16S rRNA基因序列，从众多的环境来源的估计（8，10，28）来佐证。总的来说，总微生物的基因组，发现在自然界中，我们称为宏基因组（11），比包含在培养子集包含的遗传信息。由于所有的生物系统深刻的公用事业和微生物的重要性，方法需要访问的宏基因组内的信息财富。克隆大DNA片段直接从天然环境中的微生物分离提供了一种方法来访问土壤宏基因组DNA。以前，我们研究利用细菌人工染色体（BAC）表达载体的蜡样芽胞杆菌基因组DNA（20）。是他们保持非常大的DNA插入（大于100 KB）在稳定大肠杆菌（23），促进大片段的DNA克隆的BAC载体的优势。我们的研究结果表明，从B.表达外源DNA蜡样芽胞杆菌在1大肠杆菌大肠杆菌Bac系统是在一个合理的频率（检出20），验证，低拷贝BAC载体（每单元二）（想法23）可用于大肠杆菌表达外源DNA在外国发起人大肠杆菌。在这里，我们介绍直接从土壤中分离的DNA制成的两个BAC库的建设和初步筛选。我们发现从BAC文库克隆的几个生化活动的检测水平。选定的BAC质粒编码等活动和16S rRNA基因库之一的序列分析证实我们的库中克隆的基因组信息的新颖性。结果表明，直接从土壤中提取DNA是一种新的遗传信息的重要来源，是利用BAC文库访问。我们的研究结果表明，未培养微生物的传统和功能基因组学，可以通过这种方法，筛选宏基因组活动或基因序列库，可以提供一个未培养微生物的基因组进行分析的基础上进行。材料与方法菌株和质粒。E.大肠杆菌菌株DH10B和BAC载体pBeloBAC11提供H. Shizuya（15），枯草芽孢杆菌菌株BR151（pPL608）株1E32（LYS-3 metB10 TRPC2）芽孢杆菌遗传库存中心，美国俄亥俄州立大学。-TNphoA被用作描述前（20）。从西麦迪逊农业研究站，在麦迪逊，威斯康星州（4）收集土壤DNA提取土壤。悬浮在10毫升缓冲（34），土壤（5克），并在60C孵育2小时，偶尔轻轻摇动。土壤过筛去除颗粒大于1厘米的，没有植物根系样品中可见。暂停与等体积的氯仿提取，上清液中的DNA被沉淀异丙醇（34）。沉淀DNA溶于500L水和电泳在低熔融温度的琼脂糖凝胶（SEAPlaque FMC的生物制品）。经过1小时，从凝胶两侧带电泳在100至五被切断染色本地化的DNA。DNA含地区被切断从凝胶休息（未染色）和存储，一夜之间在0.5TE（三EDTA），加多胺如前所述（网址/idx_www_tree.html） 。在无数次的实验，这种方法生产的适当规模和清洁随后克隆的DNA。构建了图书馆建设。两个BAC库，指定SL1和SL2的。兴建SL1，孤立的凝胶带含有DNA消化与Gelase（震中，美国威斯康星州麦迪逊）。根据上述列举的URL和Rondon等进行了显DIII，结扎，改造与插入DNA载体pBeloBAC11，消化制备。（20）。网格兼容96孔板上板，挑取白色菌落。该库被复制到96孔板的重复套冷冻介质，并储存在-80（33）。SL2的建设中使用的协议修改如下。载体制备如上所述，但包括结扎一步，通过凝胶纯化，以消除任何自我结扎的产品。随后从凝胶片electroeluted pBeloBAC11载体，对1TE的透析。约100微克的宏基因组DNA制备的脉冲场凝胶（Bio-Rad公司CHEFMapper;开关时间0.5秒，9伏/厘米，0.5TBE缓冲液，120夹角，5小时），与DNA更大的超过50 KB运行分离，electroeluted，对1TE的透析。插入DNA显DIII消化之后，被装上第二制备凝胶和大小选择保留40 KB或更大的DNA。如上所述结扎，转换和存储步骤进行。制备，PCR扩增，克隆和测序的16S rRNA基因序列SL148个BAC克隆池的BAC DNA的分离汇集文化如前所述（20）。详细设计扩增16S rRNA基因序列中存在污染的PCR协议大肠杆菌大肠杆菌的DNA将提交其他地方（议员离子亲石元素，Handelsman，马币古德曼，未发表的数据）。16S rRNA基因的PCR扩增（50l反应体积）用于汇集的BAC DNA的100毫微克，200M浓度的四种脱氧核苷三磷酸，2.5的UTaq聚合酶（Promega公司，美国威斯康星州麦迪逊），真杆菌和200M的特异引物结合末期修改大肠杆菌大肠杆菌特定的竞争寡核苷酸优先扩增寄主16S rRNA基因。96（1 Robocycler Stratagene公司，公司，美国加利福尼亚州拉霍亚）使用变性1分钟，94C间进行反应，然后30秒40的周期在94，90秒58C间，150 S在72，延长5分钟，72C。非大肠杆菌的存在大肠杆菌16S rRNA的产品被确定限制消化PCR产物与多种酶，包括阿鲁，三海，我和欣FI。全长PCR产品含有独特的限制性片段其后reamplified相同的PCR条件下，最终产品被克隆到TA克隆载体pGEM-T（Promega公司）。从克隆的16S rRNA基因序列信息，获得BigDye测序反应用T7和SP6的引物和ABI模式377大学，威斯康星大学麦迪逊分校的生物技术研究中心的自动测序分析。由此产生的序列进行了比较与非冗余序列数据库，为国家生物技术信息（NCBI的）用BLAST（中心1）。库筛选。，SL1被复制到Q -托盘（Genetix，基督城，马萨诸塞州）的Q-BOT（Genetix），每片含250毫升卢里亚-Bertani（LB），琼脂加氯霉素10微克每毫升（厘米）使用96针阵列。进行了单独的屏幕上的Q-托盘含厘米检测特定的琼脂培养基。复制到的Q盘，菌落培养，连续3天在30前得分表型或执行覆盖。检测-内酰胺酶的活性，板硝噻吩0.01，（碧迪微生物系统，Cockeysville，马里兰州）琼脂顶部覆盖。红色沉淀周围的殖民地表示活动。检测纤维素酶的活性，顶部含有0.1Ostazin艳红羟乙基纤维素（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州），在无菌水溶解的琼脂板被覆盖。黄色光环围绕殖民地表明纤维素酶的活性。检测蛋白酶，角蛋白酶，几丁质酶，脂肪酶的活性，库复制到含有LB琼脂加1的商业脱脂奶粉，0.5的角蛋白粉（仁川生物医学，洛杉矶，加利福尼亚州），0.5的甲壳素粉（Fluka公司的板Buchs，瑞士），或3的细菌用脂质（Difco公司，底特律，密歇根州），分别打进后3天为一个明确的光环存在。酯酶活性检测含1吐温20（Sigma公司）监测形成粉状的光环围绕殖民地的LB板。淀粉酶活性检测细菌用淀粉琼脂平板上，充斥细菌用板稳定增长 后，3天的革兰氏碘（Difco公司）;积极的殖民地由一个明亮的橙色光晕包围。DNase的活性进行了测试细菌用DNA酶甲基绿琼脂（Difco公司）;阳性克隆一个明亮的橙色光晕包围。铁载体活性测试标准CAS介质（21）包含一个额外的0.1毫米硫酸亚铁4和一个橙色的光环生产监控。在此培养基中，菌株DH10B背景活动被抑制，但仍然可以被检测到铁载体生产过剩。DH10B/pBeloBAC11在所有情况下，被用来作为阴性对照，要么控制株或纯化的酶被用于作为阳性对照。SL2的溶血活性筛选叠加5毫升血琼脂平板上，其次是2天的潜伏期为28C血琼脂中LB-CM培养基7（体积/体积）defibrinated羊血（止血实验室，迪克森，加利福尼亚州）。在初始屏幕正面的所有克隆至少一次复检。的BAC质粒的分离，并通过转化引进到一个新的背景下，复查，以确定是否克隆的DNA是负责的表现型的表型。抗菌筛选。菌落生长在37C和覆盖的LB软琼脂5毫升含0.5毫升2天二枯草BR151（pPL608）生长在LB-CM 0.2在600 nm的光密度。板过夜在37C，活动取得了二区域的抑制枯草草坪。转座子突变。BAC克隆的突变与TNphoA（19）和转座子两端测序完成前（20）。测序克隆SL1-36C7。克隆SL1-36C7被剪切超声在80的电力使用超声波均质4/10系列微尖（科尔-帕默，芝加哥，伊利诺伊州）为5秒。减弱的DNA的两端分别与T4 DNA聚合酶（New England Biolabs公司，富康，马萨诸塞州）。片段克隆到载体PCR-钝（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）根据制造商的协议，并转化大肠杆菌大肠杆菌TOP10的细胞。接种到含有100微克每毫升卡那霉素的LB琼脂转化。殖民地被挑选进深96孔板（沼泽生物制品公司，罗彻斯特，纽约州），16小时在37C生长。文化沉淀，DNA的提取，使用Qiagen公司Biorobot 9600。DNA测序使用Applied Biosystems公司染料终止化学反应和分析ABI的377机器上。提供的DNA序列数据产生六倍的覆盖。操作序列和克隆对齐SL1-36C7。DNA序列组装一个Macintosh G3的个人电脑上使用的程序Sequencher。使用EditSeq，在其中的ORF大于100 bp的开放阅读框（ORF）分析进行。推测的ORF翻译和对NCBI的非冗余蛋白质数据库查询使用高炉。使用的PSI-BLAST（1）获得额外的注释。负责抗菌活性的ORF序列GenBank登录号AF246145。亚克隆SL1-36C7抗菌的ORF扩增引物5-CATATGTCTTTCATGAAACGGTTTTTCTGT-3的ORF，编码NDE我的网站在5端，和5-CTCGAGCCTCGTAGAGTTGGGTTTGCC 3，编码Xho我在现场3月底，原BAC SL1-36C7克隆为模板。扩增DNA结扎NDE我和Xho我的消化pET22b（Novagen公司，美国威斯康星州麦迪逊）。由此产生的建设抗菌的ORF编码与3端hexahistidine标签。质粒转化大肠杆菌大肠杆菌菌株大肠杆菌BL21（DE3）（Novagen公司）。转化进行了测试抗菌活性与叠加乙枯草如上所述。重组蛋白表达和纯化。抗菌基因表达生长的细胞在4xYT中等厘米和1毫米的IPTG诱导（异丙基-（32克，蛋白胨，酵母提取物20克，5克每公升氯化钠）D-半乳糖苷），或通过让细胞泄漏通宵不经IPTG（9）。标签蛋白纯化，使用金属亲和树脂爪（Clontech公司）。结果宏基因组BAC文库的构建。要尽可能大池土壤中的微生物，包括那些不容易培养的基因组信息的访问，我们开发了从土壤中提取和克隆大DNA片段的方法。我们选择从网站已以前特点，威斯康星州麦迪逊附近的土壤和发现含有细菌和古细菌的不同社区（4，8，10）。我们使用这种DNA，构建宏基因组库中pBeloBAC11。我们准备了两个库，指定SL1和SL2的。SL1 SL2的。SL1的分子特征是原型宏基因组库和3,648克隆摆着38 96孔板组成。我们审查了约2（N = 81）; 97的克隆插入包含插入的DNA，平均插入片段大小为27 KB（图1）。我们估计，有大约100在SL1所载的DNA的MBP。根据酶切分析，克隆分为两大类：不是我在网站的插入，和那些没有内部而不是我的网站。鉴于识别序列不，我是5-GCGGCCGC的3，这表明该库中包含的DNA中GC含量变化。由于提取和克隆的步骤可能有助于在偏见的DNA库中的代表，它是重要的监控指标的多样性。图1。土壤宏基因组库中插入片段大小范围表示。一个10 kb的范围内无性系组合在一起。SL1，N = 81; SL2型，N = 132。我们构建了第二次土壤库（SL2的），实施了一些改进，为SL1使用的方法。SL2的包含24,576个克隆，平均插入大小44.5 KB，其中大于60的插入大于40 KB，132株（占总数的0.5）（图分析的基础1）。我们估计，SL2的包含1000 MBP的DNA; SL2的平均每KB基因，可能包含一百万个基因。这些统计数字表明，改善我们原来的方法，在一个库，它包含相当多的宏基因组DNA具有较大的平均插入大小。SL1。系统发育分析，要开始连接未培养微生物的生理功能和进化分析，我们开发了一种方法扩增16S rRNA基因序列的BAC质粒的筹备工作中存在的污染汇集的文化大肠杆菌大肠杆菌基因组DNA。一旦一个正从48 BAC克隆池，该池克隆单独检查，以确定携带16S rRNA基因的克隆。这表明，该序列编码的BAC克隆，而不是一个在PCR过程中污染物的结果。将来自个别的BAC克隆序列分析16S rRNA基因序列的最后确认。我们从SL1恢复了7个序列，列于表1，秋天分为四个不同的细菌门（图2）。这些数据表明，我们对DNA的提取和克隆的方法成功地恢复从广泛多样的原核生物，包括革兰氏阳性菌的DNA。表1。16S rRNA基因序列获得从SL1SL1克隆插入的大小（KB）进化组近亲的身份（使用BP号）GenBank登录号。5C223变形杆菌100，：CaulobacterSP。应变FWC21（1,437）AF2450335D236低G + C革兰氏阳性94，芽孢kobensis（1,119）AF24503416H150acidobacterium96，克隆RB41（1,437）AF24503517F930acidobacterium99，克隆32-21（1,543）AF24503659H1176变形杆菌96，PorphyrobacterSP。（1,462）AF24503765D1127cytophagales90，Haliscomenobacter hydrossis（920）AF24503867C1237cytophagales89，Hymenobacter roseosalivarius（905）AF24503916S rRNA基因序列获得从SL1图2。进化安置16S rRNA基因序列SL1。邻接的代表门类的75序列分析被用来构建树。有趣的是，我们恢复acidobacteria的序列比较相似，16S rRNA基因序列确定的文化独立的方法，比的16S rRNA基因序列，在此门的养殖品种（表1）。这些克隆提供了机会，以进一步探讨整个BAC插入序列分析和功能分析其中的基因编码，这也许是难治性栽培，这些生物体的生物学。筛选SL1和SL2的生物活性。开始调查的BAC库中捕获的宏基因组DNA的功能多样性，并确定对宏基因组DNA的克隆，我们进行了初始屏幕SL1固体培养基上的基因表达。我们发现克隆表达抗酶（克隆），抗菌（克隆），脂肪（2克隆），淀粉（8个克隆）的活动。未发现克隆表达纤维素酶，几丁质酶，酯酶，角蛋白酶，蛋白酶，溶血活性或铁载体生产。在所有情况下，BAC的分离，从公认的阳性克隆，到DH10B retransformed;复检结果转化，以确认该活动的BAC插入编码。这些结果表明，SL1包含可以表示在异源DNA序列的大肠杆菌大肠杆菌在检测水平。筛选的12个活动4 SL1确定的事实表明，这种方法可以成功地用于环境DNA的提取和识别有用的遗传信息。溶血活性，在SL2的只有屏幕上，我们确定了29个活跃的克隆。SL2的进一步筛选，预计产量等有趣的活动。SL1积极克隆表征。（一）生产DNase的克隆。DNase的生产克隆SL1-11G4包含插入一个约25 kb的酶切琼脂糖凝胶电泳分析，估计大小（未显示）。取消活动的一个转座子插入一个潜在的ORF，S1核酸从典型的米曲霉（17）和植物，包括序列（例如，萱草，大麦，百日草）位于一个特定的单链核酸的家庭同源，真菌（黑曲霉和青霉），原虫（利什曼原虫）和细菌（根瘤菌）起源（3，6，27）。该地区的扩展序列分析（未显示）确定了一个完整的ORF属于这个家庭。预测蛋白质的氨基酸SL1-11G4的氨基酸序列是最相似的利什曼原虫（6）从核苷酸相似性得分为10，-14（1）。重要的活动，在其他成员的保守也保守残留在SL1-11G4序列（未显示）（3）。我们还没有序列SL1-11G4的其他地区，以确定这种DNA片段可能起源。（二）抗菌克隆一个克隆（SL1-36C7）生产活动，是抑制到 B。枯草芽孢杆菌，弱对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌不积极反对大肠杆菌。SL1-36C7插入DNA是完全测序（图3）;片段似乎是细菌的起源，由于潜在的基因插入到已知功能的基因同源性。值得注意的是，在克隆一个基因簇存在相似的磷酸盐运输集群（的pstCAB-phoU）E.大肠杆菌（30）。这表明BAC克隆可能包含完整的，完整的操纵子。图3。示意图克隆SL1-36C7序列分析。箭头表示推测的ORF;下面是一个与每个最相似的蛋白的ORF。包括潜在的操纵ORFS 15日至21日。抗菌的ORF是27号。我们确定了负责插入失活，通过转座子诱变的抗菌活性的轨迹。出现一个单一的候选基因编码的活动。该基因的核苷酸序列表明已知序列的相似性，这表明该基因编码的蛋白质结构新颖。预测蛋白质包含一个假定的氨基末端的信号序列和至少7长重复序列（图一）。预测的氨基酸序列的疏水性的情节特征的一种膜蛋白（图4）。这个推测的ORF编码基因被克隆到表达载体pET22b单独结构作为hexahistidine标签。当转化到大肠杆菌大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，约55 kDa的产生新的蛋白质（未显示）。克隆基因赋予宿主菌的抗菌活性，证实该基因是足以产生抑制作用。然而，部分纯化蛋白，本身不活跃。查看大图：图4。（a）预期的抗菌的ORF氨基酸序列。预测蛋白质有543残留。内的重复序列高度保守，粗体，下划线，斜体突出显示重复。（二）凯特-Doolittle的疏水性抗菌的ORF档。调查是否有抗菌活性，是由于到diffusable分子，我们的分馏细胞和细胞生长介质中企图孤立的活性物质。始终原状琼脂克隆SL1-36C7已培养检测抗菌活性。然而，我们无法提取或浓缩液体或琼脂培养克隆特定的活动，利用各种生长条件，过滤步骤，有机提取物，pH值的变化。这表明该活动是不是因为到diffusable的小分子，而蛋白质本身，或在宿主细胞的影响的一些方面，可能是负责抑制活性。（三）生产淀粉酶，脂肪酶生产，和溶血性克隆。我们确定了8个克隆产生淀粉酶的活性和脂肪酶生产克隆SL2的SL1和29溶血性克隆。这些克隆的酶切分析（图5）表明，他们从独立克隆事件导致不能重复克隆的结果。各种限制模式表明克隆的BAC库中的DNA分子的多样性。查看大图：图5。（一）消化的淀粉酶和脂肪酶的克隆酶切分析，从SL1欣DIII。箭头表示BAC载体。1至8车道，淀粉酶活性克隆;泳道9日和10日，脂肪酶的克隆。（二）限制摘要SL2的溶血性克隆，消化不是一箭头表示BAC载体。1巷，大小标记。讨论土壤宏基因组的可能幅度，包括土壤中微生物的集体基因组，需要通过传统的方法要求的方法，是培养独立的大型的方法进行分析，交通不便。我们的研究结果表明在保持BAC文库E.环境DNA克隆的可行性大肠杆菌，一种方法，是两个大型和独立培养的方法。这种方法提供了一个研究的进化，物理和功能特性的宏基因组的路线。我们很容易从一个小型图书馆，仅含有100 MBP的DNA（SL1），克隆到低拷贝BAC载体的外源DNA检测基因的表达。我们还建造了一个更大的图书馆（SL2型）使用改进的方法，这表明大规模的宏基因组的BAC库建设是可能的。这里描述的直接克隆的方法提供了一个途径，以扩大土壤微生物多样性的调查，大多数的微生物，可能无法按标准方法耕种。事实上，抗菌和核酸克隆我们确定了新的序列，支持环境DNA的BAC库提供了一个新基因源的预测。我们恢复了几个BAC克隆含有16S rRNA基因序列（表1和图2）。进化推理（包括rRNA基因的编码基因以外的基因分析）是一个宏基因组分析中的关键一步，BAC文库可以作为系统发育落后的土壤中的微生物和他们的生理和遗传的BAC文库中捕获的宏基因组片段编