Feulgen反应.doc

Feulgen反应实验目的了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。实验原理DNA可在酸性条件下水解，嘌呤脱氧核糖之间的糖苷键断开，形成醛基(CHO)，再用显示醛基的特异性试剂Schiff试剂处理，形成光镜下所见的细胞核内紫红色反应产物。DNA 经稀盐酸处理而水解。除可破坏脱氧核糖与嘌呤碱外，还可水解嘧啶碱。酸水解核酸的程度与 水解时间长短有关，随着水解时间的延长，嘌呤碱基增多，形成的醛基也随之增多，Feulgen反应加强。如果水解时间过长，DNA将完全水解，反而使Feulgen反应减弱。DNA水解时间因组织种类和固定液不同而异，需通过预实验找到合适的水解温度和时间。由于Schiff试剂能与醛基结合，故不能用含醛的固定液固定组织，常用Carnoy固定液。Bouin液不适用于Feulgen反应，因为固定液中含较多的酸，可将DNA水解，影响染色反应。 Schiff试剂是显示醛基的特异试剂，其反应原理是碱性品红(为红紫色)经亚硫酸处理后变为五色Schiff液，Schiff液遇到醛基时，则被还原形成原有的颜色，即红紫色。碱性品红结构中的醌基是碱性品红中具有紫红色的核心结构，经亚硫酸处理后，则醌基两端的双键打开，形成五色品ii-硫酸复合物为Schiff试剂。如果加热使SO2逸出，则恢复品红原来的颜色而失去对DNA的染色效果，故配好的Schiff试剂应避免SO2逸出。Feulgen反应原理实验仪器、材料及试剂（一） 仪器、用具显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。（二 ）材料洋葱鳞茎（见图21）或根尖（见图22）（三）试剂11MHCl的配制取82.5ml比重1.19的浓HCl加蒸馏水至1000ml 。2Schiff试剂的配制及保存称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮 5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然后冷却至50时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1MHCl，冷却至25时，加入0.5g Na2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需23天），使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于4冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。3亚硫酸水取200ml自来水，加10ml 10%偏重亚硫酸钠（或偏重亚硫酸钾）水溶液和10ml 1M HCl，三者于使用前混匀。实验步骤1将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1M HCl中，加热到60水解810 min。 2蒸馏水水洗。 3Schiff试剂遮光染色30min。 4用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1min。 5水洗5min。 6将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。 7显微镜检查。 结果：细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应（见图23）。 对照片：方法一先将材料放在5%三氯醋酸中90水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后按步骤17制片观察。方法二材料不经1N HCl水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤47制片观察。结果（见图24）注意事项1. 对照切片的制做进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。 2. 固定剂的选择以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。 但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。 3. 水解时间Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为812min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。 4. Schiff试剂的作用Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。实验现象现象分析实验拓展Sohiff液的配制 将lg碱性品红溶于200ml煮沸的蒸馏水中，使其完全溶解，然后冷却到60过滤。加入30ml 1N HCl和3g焦亚硫酸钾(K：S：()；)或亚硫酸钠，塞紧瓶塞，置于暗处或外包黑纸24小时。1N HCl与焦亚硫酸盐生成的SO：将溶液中碱性品红脱色成为无色碱性品红(即白亚磺酸)。如溶液尚有浅黄色，可用05g活性炭脱色，摇动几分钟后迅速用粗滤纸过滤滤液应为清亮五色。制成的Schiff试剂应置于棕色瓶中，瓶塞需拧紧并用黑纸包裹，避光保存于4，保质期可达半年。若暴露于空气，或加热则使Schiff试剂中的S02逸出，变性的Schiff试剂则不能使用。除碱性品红外。其他碱性染料也可制成能与醛基反应的类似Schie 反应液，但是。不能达到五色。在染色时可用l盐酸乙醇洗去不起反应的余色。Schiff试剂在不同的pH条件下可显示不同的物质，如Sehiff试剂在pH 3043时，对Feulgen反应效果好，而pH 24时，对PAS(糖原)反应效果好。 注意：Schiff试剂虽无色，但氧化后为紫红色。同时要防止污染环境，用后要回收。生色基团-正文也称发色团。为有机化合物中能发生颜色的某种原子基团（见基），其特征吸收（见表）较少受化合物中其他原子或基团的影响。它们常是一些硝基-NO2、亚硝基-NO、偶氮基-NN-