发酵工程——森.doc

1初级代谢产物：对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物。2次级代谢产物：非微生物生长所必需的物质。3营养缺陷型：通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。4野生型：指在野生群体中观察到的最高频率的表型，或具有这种表型的系统、生物和基因。54种育种方法：自然育种：自然选育指在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程。 诱变育种：通过诱变剂处理,提高菌种的突变频率,扩大变异幅度,从中选出具有优良特性的变异菌种。 杂交育种：指两个不同基因型的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新形状的菌株。 分子育种：通过基因重组使受体细胞内无性繁殖。6自然育种突变频率低为什么生产上还要进行自然育种？自然育种淘汰衰退的菌株，保存优良的菌株，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产和提高发酵产量的目的。7六大营养要素：（1）碳源（主要看糖类P67）：a. 葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖b. 糊精、淀粉及其水解物 使用条件： 微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类c.糖蜜(蔗糖、乳糖、麦芽糖) 糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。 （2）氮源(P68) 无机氮源：氨盐、硝酸盐和氨水 有机氮源：一些廉价的原料:花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。（3）能源（4）生长因子：凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 （5）无机盐：Na+维持细胞渗透压的功能 K+影响细胞膜的透性 Ca2+调节细胞透性，发酵液中磷酸盐含量（6）水8培养基的类型：按成分了解程度分（天然培养基、合成培养基、半合成培养基 ） 按状态（固体培养基、半固体培养基、液体培养基） 按用途（斜面培养基、种子培养基、发酵培养基）9生长曲线的四个阶段：延滞期、对数期、稳定期、衰亡期10生理酸性物质：经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质（硫酸胺）生理碱性物质：若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质（硝酸钠）11离子功能：Na+维持细胞渗透压的功能K+影响细胞膜的透性Ca2+调节细胞透性，发酵液中磷酸盐含量12生长因子：微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。产物促进剂：所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。 13灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。 消毒：是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。灭菌与消毒相比，要求更高，处理更难。灭菌必须选用能杀灭抵抗力最强的微生物（细菌芽孢）的物理方法或化学灭菌剂，而消毒只需选用具有一定杀菌效力的物理方法、化学消毒剂或生物消毒剂。灭菌实质： 杀菌：指菌体虽死，但形体尚存 溶菌：指菌体杀死后，其细胞发生溶化 14（1）分批灭菌：将配制好的培养基输入发酵罐内，用直接蒸发加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度，这过程称为分批灭菌。（2）连续灭菌法：配好的培养基在通入发酵罐时进行的加热、保温、降温的灭菌过程，称为连续灭菌。15空气灭菌的方法：辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电灭菌、过滤介质灭菌。（重点掌握过滤介质灭菌） 16空气净化工艺流程图：1.空气吸气口 2.粗过滤器 3.空气压缩机 4.一级空气冷却器 5.二级空气冷却器 6.分水器 7.空气贮罐 8.旋风分离器 9.丝网除沫器 10.空气加热器 11.总空气过滤器 12.分过滤器采用上述系统制备无菌空气，要提高空气进入压缩机之前的洁净度（措施：提高吸气口的高度、空气进入压缩机之前先经过粗效过滤器，以减少进入空压机的大颗粒灰尘，保证压缩机的效率）以及除尽压缩空气中夹带的油水（是为了保护过滤介质不被污染）。17通气风量VVM :单位时间(min)单位体积(m3)培养基中通入标准状况下空气的体积(m3)。18.染菌：发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖。造成染菌的因素：设备渗漏、空气带菌、种子带菌、灭菌不彻底、技术管理不善。19染噬菌体的现象：碳源和氮源的消耗减慢，发酵周期延长，pH值异常变化，泡沫剧增，发酵液色泽和稠度改变，菌体裂解和减少，引起光密度降低和产物锐减。污染严重时，无法继续发酵，应将整罐发酵液报废。 20种子扩大培养：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。种子扩培的目的：获得纯而壮活力旺盛的菌种、获得满足接种量要求的培养物、在扩大过程中，对菌种进行驯化、最终实现缩短发酵时间，保证生产水平。21种龄：指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种量：移入种子的体积和接种后培养液的体积的比值。22种子异常表现：菌种生长发育缓慢或过快、菌丝结团、菌丝粘壁。23理想的菌种保藏方法应具备的条件：低温、干燥、真空24工业微生物菌种保藏技术：定期移植保藏法、液体石蜡保藏法、沙土保藏法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法、固体曲保藏法。25菌种复壮措施：（1）纯种分离：采用自然分离的方法，将衰退菌种的细胞群体中,一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，通过扩大培养可以恢复菌种的原有性状。（2）淘汰衰退的个体：利用芽孢的耐热性，进行热处理，对不产芽孢的个体进行淘汰。（3）选择合适的培养条件：一般将保藏的菌种接种在保藏前所用的同一培养基上，有利于菌种原有性状的恢复。26发酵过程操作方式：（1）分批发酵（P129）是指在一封闭培养系统内含有初始限制量的基质的发酵方式。（2）补料分批发酵 是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长。（3）连续发酵 发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。27补料分批培养的优点：(1)可以消除底物抑制。(2)可以达到高密度细胞培养。(3)延长次级代谢产物的生产时间。(4)稀释有毒代谢产物。(5)操作和控制都比较简单。28初级代谢的代谢变化：基质：一般随发酵时间的延长而不断下降，被用于菌体生长繁殖和产物的合成。菌体：延滞期、对数期、静止期和死亡期产物：随菌体的生长在不断的进行，有的与菌体的生长呈平行关系29次级代谢的代谢变化：菌体生长繁殖阶段（生长期）与产物形成阶段（生产期）是分开的，即非偶联型。代谢一般分为菌体生长期、产物合成期和菌体自溶期菌体生长阶段：营养物质浓度减少，菌体浓度明显增加，溶解氧不断下降，pH值也发生一定改变。营养物降到一定程度，菌体生长减慢，直至达到菌体的临界浓度。期间，积累了代谢中间体；与次级代谢有关酶被解除了控制，为产物合成做好了准备。产物合成阶段： 菌体的生长达到恒定贮藏期：细胞干重继续增加，开始形成产物持续期：细胞干重不变，继续耗糖和分泌产物。菌体自溶阶段：菌体衰老，细胞开始自溶，产物合成能力衰退，生产速率下降。30菌体浓度：单位体积培养液中菌体的含量。31发酵过程的pH控制：发酵过程pH变化的原因：1.基质代谢 2.产物形成 3菌体自溶 糖代谢：特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一； 氮代谢：当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。 生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降。 有机酸类产生，使pH下降 红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。 菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。 微生物发酵的合适pH一般在58之间。32摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmol O2L-1h-1 。Kla: 以(C*-C)为推动力的体积氧传递系数 h-1提高溶氧的方法： 1）.供养 改变通气速率（供气量） 提高罐压 在通入的空气中掺入纯氧，提高氧分压 提高设备的供氧能力（KLa）增加搅拌，改变供气方式 2）.需氧养料的丰富程度影响菌体的生长 温度的影响33发酵过程泡沫产生的原因：通气搅拌的强烈程度（通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此）；培养，基配比与原料组成（培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌）；菌种、种子质量和接种量（菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少）；灭菌质量（培养基灭菌质量不好，糖、氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫）34起泡的危害：降低生产能力（降低了发酵罐的装料系数，大多数罐的装料系数为0.6-0.7）；引起原料浪费（如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费）；影响菌的呼吸（泡沫严重，无法进行搅拌，促进氧传递，如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸）；引起染菌（由于泡沫增多而引起逃液，于是在排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会长入发酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，轴封处的润滑油可起点消泡作用，从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染）；消泡剂的加入会使下游工程的分离带来困难35常用消泡剂的种类：（1）天然油脂:玉米油、米糠油、豆油、棉子油、鱼油及猪油 （2）聚醚类消泡剂：它是以甘油为起始剂，由环氧丙烯，或环氧乙烷与环氧丙烯的混合物进行加成聚合而制成的。 （3）高碳醇、脂肪酸和