细胞与组织化学.ppt

目录 第一章概述第二章组织学的研究方法第三章光镜标本制作第四章光学显微技术第五章组织细胞化学第六章免疫组织细胞化学第七章原位杂交组织化学第八章细胞分离技术第九章细胞培养与组织工程第十章形态计量分析术 第一章概述 第一节概述第二节组织细胞化学的发展史 第一节概述 1 组织化学和细胞化学组织化学是研究整个组织 而细胞化学是研究单个细胞 细胞和组织化学中的科学技术为细胞和组织中定位特定的化合物提供了方法 Eg 组织切片与目标酶的底物一起孵育 这一反应的产物与存在于孵育混合物中的色素发生反应 如果样品在孵育前固定的很好 且固定过程没有对酶造成损伤 那么这个过程将会使组织薄片中含酶的细胞在显微镜下显现 若显微镜具有更高的分辨率 还可以将含有该酶的亚细胞器显现 组织化学 histochemistry 和细胞化学 cytochemistry 技术的基本原理是在组织切片上或被检材料上 加一定试剂 使它与组织或细胞中待检物质发生化学反应成为有色沉淀物 以用光镜观察 若为重金属沉淀 可以用电镜观察 称电镜组织化学 electronmicroscopehistochemistry 这种方法可用于检测细胞内的酶类 糖类 脂类 核酸与某些多属元素等 如进一步应用显微分光光度计等测定标本中沉淀物的强度 则能较精确地进行定量研究 2 研究组织 细胞传统的化学方法 糖类显示法最常用于显示细胞 组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸 雪夫反应 periodicacidSchiff PAS反应 基本原理是 糖被强氧化剂过碘酸 HIO4 氧化后 形成2 醛基 后者与Schiff试剂中的无色品红亚硫酸复合物结合 形成紫红色反应产物 PAS反应阳性部位即表示多糖的存在 酶类显示细胞内含有多种酶 每一种酶可催化一定的化学反应 酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存在 而不是酶的本身 将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液中孵育 底物经酶的作用形成初级反应产物 它再与某种捕捉剂相反应 形成显微镜下可视性沉淀 即最终反应产物 如欲显示细胞内酸性磷酸酶 先将切片放入含有酶底物 常用 甘油磷酸钠 的溶液 PH5 0 中孵育 底物经酶的作用 水解并释放出磷酸 用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应 形成微细的磷酸铅沉淀 此时 可在电镜下检出 如再用硫化铵处理时 磷酸铅被置换成硫化铝沉淀 可在光镜下见到 脂类显示脂类物质包括脂肪与类脂 标本可用甲醛固定 冷冻切片 用油红 苏丹 苏内 苏丹黑B 尼罗蓝等脂溶性染料染色 亦可用饿酸固定兼染色 脂类呈黑色 核酸显示法显示DNA的传统方法为Feulgen反应 切片先经稀盐酸处理后 使细胞内DNA水解 打开DNA分子中胶氧核糖核酸和嘌呤碱之间的连接键 使其释放出醛基 再用Schiff试剂处理 形成紫红色反应产物 如用甲基绿 派若宁反应 可同时显示细胞内的DNA和RNA甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿色 派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色 3 现代意义的细胞与组织化学包括电镜细胞化学 免疫细胞化学 显微放射自显影 流式细胞术 细胞染色体DNA原位杂交 胞内ca2 测量等 细胞是一个生命体 组织的构成也是由细胞组成 在研究生命规律及探索生命规律的过程中 要应用到许多技术和方法 从而产生了组织和细胞化学等学科 其发展过程为 1 早期 用放大镜看细胞及组织的形态 局限于对细胞及组织进行形态描述 2 后期 由于近代物理学 化学及生物等学科的发展 为人们研究细胞内结构及组织切片方法提供了丰富的知识和条件 观察细胞的生命规律及组织切片需建立和应用的手段 到现在已经经历了一个漫长的发展过程 并取得了长足的进步 如放射免疫技术 电镜细胞化学 免疫细胞化学 显微放射自显影等技术已应运而生 第二节组织细胞化学的发展史 第二章组织学的研究方法 第一节概述第二节组织学制片概述第三节取材和固定第四节固定后的处理第五节染色及染色方法 第一节概述 组织学 histofogy 是应用显微镜研究机体微细结构及其相关功能的科学 是在解剖学的基础上从宏观到微观发展形成的 故又被称为显微解剖学 microscopicanatomy 组织学的研究内容 首先要研究组成机体的形态结构与功能单位 细胞 继而研究在细胞及其产物所组成的基本组织 primarytissue 上皮组织 结缔组织 肌肉组织和神经组织 在此基础上研究各器官系统的微细结构及其有关功能 组织学是重要的基础课程 只有对机体微细结构的深入了解才可能透彻地阐明其功能 组织学的研究极大地促进了生理学的发展 生物化学的进步也促进了组织学的发展 例如 将生物化学及分子生物学的原理用于组织学而建立起组织化学及分子细胞学 将免疫学的原理用于组织学而建立起免疫组织化学等 从而使人们得知各种细胞与组织的化学组成 分子结构及其基本生命现象 这些知识已成为现代组织学的重要组成部分 第二节组织学制片概述 1 组织学制片方法非切片法直接取物体进行观察 不用切片机 不经切片手续而制成切片的方法 包括 a 整体封藏法eg水螅鸡胚蛙胚b 涂片法针对液体或半液体 Eg血液骨髓腹水c 活体标本观察法eg蛙口腔黏膜的纤毛运动细胞吞噬d 分离法eg分离三种肌细胞神经纤维脊髓前角神经细胞e 铺片法eg肠系膜可观察肥大细胞弹力纤维胶元纤维等f 磨片法eg骨组织或牙齿切片法需依靠切片机将组织切成薄片的方法 2 组织切片制作流程 杀死 取材与固定 洗涤 脱水 透明 透入 包埋 切片 贴片 染色 封藏 第三节取材和固定 1 取材与固定 组织切片制作的关键步骤 取材 首先动物组织需从动物体中取出 方法有多种 主要是视材料的种类 实验动物个体大小及观察的目的而定 杀死的方法 大的个体 实验动物 用刀 斧头 麻醉等方法 小的个体 实验动物 采用大号剪刀或断头法等 取材注意事项 取材需速度快 取材以后 应立即进行固定 否则细胞会自溶 鱼杀死后2小时再烹调比刚处理完就烹调的味道要更鲜美 这是细胞自溶导致的结果 固定 固定的目的 防止组织腐败及自溶 将所需要的物质原位沉淀 保存 尽量使各种成分保持与原来 活着 的状况相仿 3 沉淀下来以后 会造成组织的折光率的变化 即增加折光性 并使易染色 4 通过固定以后 使组织产生硬化现象 有利于切片的制作 2 固定的对象构成细胞的主要物质是蛋白质 它分散在细胞内 所以固定的对象是蛋白质 作为固定剂的化学试剂必须具有能凝固或沉淀蛋白质 脂肪等成分 并具有强的渗透力 固定剂必须具备的性质 1 迅速渗入组织杀死原生质 渗透速度要快 即很快能将细胞杀死 固定不会使组织很快产生变化 2 渗透要均匀 使组织内外尽量保持一致 3 尽量避免出现膨胀和收缩状况 4 尽量避免使组织块变形 卷曲 5 使细胞内蛋白质凝固 沉淀 6 增加折光性 媒染作用和染色能力 7 使组织变硬 适于切片 但又不至于使材料坚硬而松脆 8 固定以后 又能有保存组织的特性 如用福尔马林浸泡 3 组成固定剂的性质和条件 4 固定剂的作用方式 三种 1 使蛋白质变性 蛋白质变性会成为沉淀物质 其是不可逆的 例 酒精使蛋白质变性不是与蛋白质形成化合物 而是使蛋白质脱水而使之变性 2 固定剂与蛋白质发生化合作用 改变了蛋白质的结构 产生沉淀 3 使蛋白质冻胶化 固定液与蛋白质间起了化学上的结合 改变了分子结构 不产生沉淀 是使蛋白质凝胶化 并不溶与水 5 固定剂的媒染效果生活细胞大多不易染色 但经过固定后便易染色 这是由于固定剂与蛋白质相结合 同时也能与染料分子结合 从而使蛋白质着色 6 固定剂的穿透率 穿透率要强 迅速 才能在短时间内使组织内外都得到固定 7 取材和固定应注意事项1 固定的材料要新鲜 组织会产生自溶 夏天不超过2 4小时 材料取出后应立即固定 有些组织自溶很快 冬天不超过12小时 2 取材的部位要准确 要清楚所需的材料位于动物体内哪个位置 3 取材工具要锋利 动作需仔细 4 切取的组织块必须小而薄 一般取0 3 0 5mm厚的组织块进行固定 5 清洗 如小肠组织需清洗其内的黏液及食物残渣 才能投入到固定剂内 6 组织块附加标记的方法 组织块取得较多并放在同一容器内 易发生混淆 应加标签以区别之 并注明固定液 材料 日期等 7 固定剂的用量 固定组织 一般所采用的固定液体积为组织块的10 15倍 容器勿过小 材料勿太多 8 常见固定剂的性质及使用 单纯固定剂A甲醛 纯甲醛为一种气体 溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林 市面上出甲醛浓度通常为37 40 甲醛使用时 需采用新鲜的 放置时间较长的甲醛会变成多聚甲醛 为强的还原剂 其不可与氧化剂混合使用 作为固定剂的优点 渗透力强 使组织收缩少 固定均匀 能较好的固定脂肪 神经及髓鞘 且能固定高尔基体 线粒体 缺点 不能固定白蛋白和核蛋白 B乙醇 为无色透明的液体 其可与水混合 优点 可以沉淀白蛋白 球蛋白 核蛋白 穿透力强 渗透力较弱 缺点 不宜作低温固定 酒精浓度超过50 可溶解组织内的脂肪 类脂体 血色素等 C醋酸 具刺激味的无色液体 固定组织通常用5 的HAC PH2 6 防止细胞自溶 优点 其能沉淀核蛋白 是种好的染色质固定剂 穿透速度快 固定时间较短 通常1小时即可 缺点 其不能沉淀白蛋白 球蛋白使组织膨胀 高浓度HAC会破坏线粒体和高尔基 D苦味酸 常见的一种酸 为一种强酸 黄色结晶 其在干燥空气中激烈晃动 会发生爆炸 苦味酸的运输以溶解在水中的饱和苦味酸 浓度为1 作为固定液的优点 能沉淀所有的蛋白质 穿透力强 缺点 使组织收缩 E重铬酸钾 橙红色的结晶 强氧化剂 不可与还原剂 酒精 等混用 重铬酸钾溶液中加醋酸后 产生铬酸 才能使蛋白质产生沉淀 优点 穿透力较强 缺点 使组织产生一点膨胀 F 锇酸 四养化锇 为黄色的结晶 为强的氧化剂 优点 其为脂肪及类脂体的唯一的固定剂 能将线粒体及高尔基体固定成为黑色 穿透速度慢 可保持组织柔软 缺点 较难固定组织 毒性高 易损伤眼睛及黏膜 价格昂贵 G氯化汞 通称升汞 剧毒 呈白色粉末状 以针状结晶为最纯 能沉淀一切蛋白质 包括核蛋白 优点 其对蛋白质有较强的沉淀作用 能充分固定细胞质和细胞核 二 混合固定液 Bouin液苦味酸饱和水溶液甲醛冰醋酸该固定液渗透力强 使组织收缩少 固定时间12 24小时 Carnoy液无水乙醇氯仿冰醋酸对组织穿透速度快 多用于糖原 脱氧核糖核酸固定 Zenker液重铬酸钾升汞双蒸水冰醋酸采用该液 须脱汞处理 Helly液重铬酸钾升汞双蒸水甲醛 第四节固定后的处理 1 洗涤洗涤的目的组织在固定后一定要把渗入组织里面的固定液洗去 然后进行下一个过程 为防止组织中留有较多的固定剂影响脱水剂 甚至可在组织中发生沉淀或结晶而影响观察 特别是对陈旧性标本更应注意流水冲洗 尽可能减少组织中的酸性程度和甲醛色素 对于混合性固定液 更应及时洗涤 有利于脱水 切片和染色 洗涤的方法1 固定剂以水配置者用流水冲洗 可使组织中固定液随时溢出和随时洗去 大的动物组织冲洗时间为24小时左右 小动物组织冲洗时间为2 10小时 冲洗的时间基本根据固定的时间而定 新鲜的标本固定时间短 需及时脱水者 冲洗时间短 固定时间短 2固定剂含乙醇者一般不要求冲洗 如需冲洗必须采用与固定剂溶度相近的乙醇冲洗 3特殊固定液洗涤法1 重铬酸钾流水冲洗12 24小时 或用亚硫酸 或用1 含氯水溶液进行洗涤 2 锇酸流水冲洗12 24小时 务必冲干净 3 苦味酸用50 或70 乙醇浸泡 尽量洗去黄色 4 氯化汞用0 5 碘酒溶液反复加入到70 乙醇中 直至黄色不再褪去为止 再用硫代硫酸钠或70 乙醇洗去碘 2 常用脱水剂乙醇为常用的脱水剂 脱水能力强 并能使组织硬化 一般的脱水顺序是70 80 90 95 I 95 II 无水乙醇I 无水乙醇II 无水乙醇III 应注意的是脱水必须在有盖的瓶子内进行 丙酮沸点为56 脱水作用比乙醇强 但对组织块的收缩较大 脱水时间通常为1 3小时 正丁醇为无色液体 沸点100 118 微溶于水 一般使用方法为 组织块经固定及冲洗后先入50 70 80 乙醇中脱水 然后转入正丁醇12 24小时浸蜡 叔丁醇是异丁醇的一种 无毒 熔点为25 电镜上常用的中间脱水剂 3 透明透明的目的在制片过程中有两次透明 第一次是脱水以后的透明 第二次透明是染色后的切片透明 组织块透明的目的是便于浸蜡包埋 切片透明目的是有利于光线的透过 便于显微镜的观察 透明剂的种类1二甲苯2甲苯3苯4香柏油 4 浸蜡与包埋5 包埋6 切片7 贴片8 染色 第五节染色及染色方法 1 天然染料苏木精本身不作为染料 其氧化产物苏木红才作为染料 氧化的方式 1 自然氧化作用2 化学氧化作用卡红靛兰地衣红巴西木素 2 人工合成染料生色团与助色团酸性 碱性与中性染料1 酸性染料 阴离子染料 生色团位于其分子的阴离子处 2 碱性染料 阳离子染料 生色团位于其分子的阳离子处 3 异染现象染料离子以某种方式使它对所吸收的波长有所改变 因而观察到被染的组织显示与该染料本身颜色不一样 此现象为异染现象 4 荧光染料是指需要经过波长很短 低于400nm 的紫外线照射激发以后而发出荧光的一类特殊染料 第三章光镜标本制作 组织学的研究方法很多 并随着科学技术的发展 又不断创建新技术 在应用中要根据研究的目的和内容 选用相应的方法才能获得预期的效果 这里仅就最常用 最基本的一些方法做简要介绍 第一节涂片 铺片 磨片标本的制备第二节切片标本的制备 第一节涂片 铺片 磨片标本的制备 1 涂片标本的制备涂片 smear 法是常用的一种方法 如血液等可直接涂于载玻片上制成涂片标本 干燥后进行固定 染色及封固 2 铺片标本的制备 stretchedpreparation 用于疏松结缔组织 神经等柔软组织或肠系膜等薄层组织 可将其铺于载玻片上 撕开 展平制成铺片标本 待干燥后进行固定染色 3 磨片标本的制备 groundsection 用于坚硬组织的标本制作 如骨和牙等坚硬组织除用酸 如稀硝酸 脱钙后再按常规制成切片标本外 也可直接将其磨成薄的磨片标本进行观察 第二节切片标本的制备 观察机体各部的微细结构时 首先要制成薄片 就是切片法 其中以石蜡切片 Paraffinsection 最为常见 其制备程序大致如下 取材与固定 取材要尽量新鲜动物材料 取得新鲜材料后 切成适当的小块1 0立方厘米大小 立即投入固定剂 fixative 中进行固定 使组织中蛋白质迅速凝固 防止组织自溶或腐败 以保持生活状态下的结构 常用的固定剂有甲醛 酒精 醋酸 苦味酸 饿酸等 脱水 dehydtation 透明 clearing 与包埋 embedding 把固定好的材料用乙醇将组织内的水分脱掉 经二甲苯透明后 再浸入已融化的石蜡中进行浸透 包埋 切片 section 与染色 staining 用切片机 microtome 切成5 10 m的薄片 贴于载玻片上 脱蜡后进行染色 最常用的染色法是苏木精 hematoxylin haematoxylin 和伊红 eosin 染色简称HE染色 配制后的苏木精染液呈碱性 可使细胞核内的染色质及细胞质内的核糖体等染成蓝紫色 称嗜碱性 basophilia 伊红是酸性染料 可使多数细胞的细胞质染成粉红色 称嗜酸性 acidophilia 耐碱性和酸性染液亲合力都不强的 称为中性 neutroPhilia 封固 mounting 切片经脱水 透明后 于切片上滴加中性树胶和盖片进行封固后 贴标签备用 除HE染色外 还有多种染色方法 有的能特异性的显示细胞内某些结构 如使用雷锁辛品红 resorcin fuchsin 染液显示组织内的弹性纤维 有的细胞经重铬酸盐处理后 呈棕褐色 称嗜铬性 chromaffinity 有的组织成分经硝酸银处理时 可使硝酸银还原 形成银微粒附着在组织中呈棕黑色 该特性称为亲银性 argentaffin 有的组织结构成分 本身不能使硝酸银还原 需加还原剂方能使硝酸银还原 形成棕褐色很微粒附着在组织结构上 这种性质称为嗜银性 argyrophilia 如肥大细胞中的颗粒经甲苯胺蓝 tofuidineblue 等碱性染料染色后 呈紫红色 这种现象称异染性 metachromasia 其原理可能是染料在溶液中以单体存在时呈蓝色 当它与颗粒中具有大量阴离子的多糖成分耦合后 聚合成多聚体而呈紫红色 除石蜡切片外 在制作较大结构 如眼球 睾丸等 的切片时 常用火棉胶包埋法 骨和牙等坚硬的组织 可用弱酸 稀硝酸 脱钙后 用石蜡或火棉胶切片 celloidinsection 法制成切片标本 还有 为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要 可选用冷冻切片 frozensection 它是将组织先在低温下快速冻结 经直接切片后进行染色 或将组织块置入液氮 196 内快速冷冻 用恒冷箱切片 cryostatsection 后进行染色 第四章光学显微技术 第一节光镜技术第二节电子显微镜技术 第一节光镜技术 几种特殊显微镜术 相差显微镜干涉微分相差显微镜荧光显微镜暗视野显微镜共焦激光扫描显微镜 相差显微镜 是用于观察生活细胞或未经染色细胞的形态结构 生活细胞无色透明 细胞内各种结构间的反差很小 在一般光学显微镜下难以观察到细胞的轮廓及内部结构 必须使用相差显微镜 相差显微镜的结构特点是 装有不同大小环状光阑的聚光器 物镜内装有位相板 中心望远镜装置 相差显微镜的基本原理是通过上述装置 把透过标本的可见光的相位差变成振幅差 从而提高了标本内各种结构之间的对比度 使标本中的结构清晰可辨 若观察生长在培养瓶中的生活细胞 则需应用倒置相差显微镜 invertedphasecon trastmicrosope 它与相差显微镜基本相同 它的特点是物镜安装在载物台的下方 光源及长焦距聚光器安装在载物台的上方 可以对体外培养细胞进行长时间观察 拍照 摄电影及录像等以记录生活细胞的行为 干涉微分相差显微镜 基本原理与相差显微镜非常相似 但它有一装有分光器的聚光器 利用分光器将光束分为两组 一组光束通过被检物 另一束则通过周围介质 旋转检偏器 光的干涉形成光程差 可随旋转 两光束形成不同的角度 于是被检物呈现出不同颜色 致使生活细胞如同染上颜色一样 故又称为光染色 它与相差显微镜相比 除有鲜艳的颜色外 在细胞周围不出现明亮的晕环 荧光显微镜 是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布 它是装有 能产生紫外线 短波长 的光源及系列滤片装置的显微镜 由于紫外线的照射 标本中的荧光物质吸收光能后 呈现出不同颜色的荧光 这是自发荧光 如维生素A呈绿色荧光 心肌细胞内脂褐素呈棕黄色 金黄色荧光 但是 细胞内的某些成分只有与荧光素结合后 在紫外线的激发下 始可呈现一定颜色的荧光 如应吖啶橙 荧光素 处理细胞后 细胞核内的DNA呈绿 黄绿色荧光 细胞质及核仁内的RNA呈桔黄 桔红色荧光 利用荧光染色法及荧光显微镜可以观察组织 细胞的结构 细胞内某些成分含量的变化 并探讨细胞的功能状态 或用荧光素标记免疫球蛋白 进行免疫荧光细胞化学研究 暗视野显微镜 特点是该显微镜具有暗视野聚光器 使光线不直接进人物镜 故呈暗视野 该显微镜适用于观察细胞内微小颗粒 例如线粒体 细菌运动等 人眼的分辨力为200um 普通光镜为0 2um 而暗视野显微镜的分辨力为其50倍 为004um 共焦激光扫描显微镜 是80年代初研制成功的一种高光敏度 高分辨率的新型仪器 它的主要特点是 以激光作为光源 采用共焦成像系统 扫描 显示及记录系统 激光具有发散角小 方向性好的优点 光束通过聚焦后落在样品 如细胞等 的不同深度 在不同方向 不同深度的平面上进行聚焦扫描 从而得到一系列不同层次的清晰图像 平面间隔最小约600 800nm 利用微机图像合成系统可重建细胞的三维图像 可对细胞进行体视学的定量分析研究 CLSM可以更精确地检测 识别 组织或细胞内的微细结构及其变化 由此 CLSM又有细胞CT之称 第二节电子显微镜技术 目前 电子显微镜技术 electronmicroscopy 已成为研究机体微细结构的重要手段 常用的有透射电镜 transmissionelectronmicroscope TEM 和扫描电子显微镜 scanningelectronmicroscope SEM 与光镜相比电镜用电子束代替了可见光 用电磁透镜代替了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电子束成像 成像原理 透射电镜技术扫描电镜术冷冻蚀刻复型术冷冻割断术 透射电镜技术 透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像 投射到荧光屏上或照相底片上进行观察 透射电镜的分辨率为0 1 0 2nm 放大倍数为几万 几十万倍 由于电子易散射或被物体吸收 故穿透力低 必须制备更薄的超薄切片 通常为50 100nm 其制备过程与石蜡切片相似 但要求极严格 要在机体死亡后的数分钟钓取材 组织块要小 1立方毫米以内 常用戊二醛和饿酸进行双重固定树脂包埋 用特制的超薄切片机 ultramicrotome 切成超薄切片 再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色 电子束投射到样品时 可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射 如电子束投射到质量大的结构时 电子被散射的多 因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像 电子照片上则呈黑色 称电子密度高 electrondense 反之 则称为电子密度低 electronlucent 扫描电镜术 扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描 将产生的二次电子用特制的探测器收集 形成电信号运送到显像管 在荧光屏上显示物体 细胞 组织 表面的立体构像 可摄制成照片 扫描电镜样品用戊二醛和饿酸等固定 经脱水和临界点干燥后 再于样品表面喷镀薄层金膜 以增加二波电子数 扫描电镜能观察较大的组织表面结构 由于它的景深长 1mm左右的凹凸不平面能清所成像 故放样品图像富有立体感 冷冻蚀刻复型术 冷冻蚀刻复型 freezeetchreplica 是电镜样品的一种制备技术 以显示细胞 组织微细结构的立体构像 其样品制备步骤如下 冷冻 先把组织浸入含有20 30 的甘油生理盐水的冷冻保护剂中 以防止冰晶形成和提高冷冻速度 然后把组织放入液氮 196 内快速冻结 断裂在低温真空内 把冻结的组织用钢刀劈开 断裂面常为组织 细胞的薄弱部位 如膜的双层类脂质分子的疏水极之间余下部分的表面要观察的部位冷冻蚀刻 蚀刻 在真空内将温度回升到 100 使断裂面的冰升华 形成凹凸不平的形态 复型 在断裂面以45 角喷镀一层铂膜 以增加图像的反差和立体感 再喷镀一层碳膜以加固铂膜 然后用次氯酸钠等腐蚀液除去组织 捞取复型膜在透射电镜下观察 冷冻蚀刻复型技术是研究细胞膜相结构的重要手段 细胞膜的双层类脂质层被劈分开后 其外层的内表面称胞质外面或E面 extracellularface E face 其内层的外表面称胞质面或P面 plasllllcface P face 在P面常可见许多直径6 9nm的膜内粒子 而E面则较少 一般认为腹内粒子是细胞膜和细胞内膜相结构中的镶嵌蛋白质粒子的图像 膜内粒子的数量与分布随膜的功能状态而变化 因此 可应用冷冻蚀刻复型求研究膜结构与功能的关系 冷冻割断术 freezecracking 将固定组织经过处理后 置于特制的冷冻台上 浸于二甲基亚砜中 低温下将组织割断 断面喷镀合金 在扫描电镜下观察组织结构断面的立体图像 第五章一般组织细胞化学 现代细胞生物学发展是靠形态观察结合生物化学和分子生物学研究来推动的 没有这些相关学科的发展也就没有现代细胞生物学 组织化学或细胞化学染色 histochemicalorcytochemicalstaining 是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理 对某种成分进行定性或定位研究的技术 利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示 包括有无机物 醛 蛋白质 糖类 脂类 核酸 酶等 1 固定 目的是将细胞与组织的结构和化学物质双重地保存下来 固定细胞与组织的方法有 物理固定 如血膜空气快速干燥 冷冻干燥或直接冷冻切片 化学固定 如甲醇 乙醇 丙酮 甲醛 戊二醛和锇酸等试剂均能对组织细胞结构和其中的某些化学物质加以固定保存 不同化学试剂所保存的化学成分 对酶活性的影响 保存结构的细腻度均不相同 因此 要根据实验要求和组化反应 选择最佳的固定方法和固定剂 如显示多糖常用乙醇固定 而显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定 2 显示方法 金属沉淀法 利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀 借以辨认所检查的物质或酶活性 如磷酸酶分解磷酸酯底物后 反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀 而显示出酶活性 偶氮偶联法 酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料 Schiff反应 细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色 这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸 Feulgen反应 联苯胺反应 过氧化物酶分解H202 产生新生氧 后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝 进而变成棕色化合物 普鲁士蓝反应 三价铁与酸性亚铁氰化钾作用 形成普鲁士蓝 Formazane反应 显示脱氢酶 Nadi 反应 显示细胞色素氧化酶 脂溶染色法 借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色 茚三酮反应 显示蛋白质 第六章免疫组织细胞化学 免疫细胞与组织化学 immunocytochemistry 是根据免疫学原理 利用抗体同特定抗原专一结合 对抗原进行定位测定的技术 抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子 抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的 球蛋白 如果将抗体结合上标记物 再与组织中的抗原发生反应 即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位 第一节抗体的分类及其特性第二节免疫组织化学的基本原理第三节抗原抗体的制备 第一节抗体的分类及其特性 1 抗体的分类单克隆抗体多克隆抗体基因工程抗体 2 抗体的特性亲和力指抗原决定簇和同源抗体结合位点间的反应力 即分子间吸引与排斥力的总和 抗体与抗原结合的专一性和交叉性1 抗原 抗体反应的专一性 指针对抗原决定簇的抗体不能与第二种抗原决定蔟互补 即一种抗体只能与一种抗原决定蔟反应 2 当抗原A的某些抗原决定蔟与第二种抗原B中的某些抗原决定蔟相同时 一部分抗体A会与抗原B进行反应 抗体效价指抗体在保持其最佳特异性染色 并且具备最小背景条件下的最高稀释倍数 抗体的稳定性其稳定性受盐浓度及pH等因素的影响 第二节免疫组织化学的基本原理 免疫组织化学是免疫学与组织化学相结合的一个分支学科 以免疫学的抗原 抗体反应为理论基础 一其全过程包括 A抗体的制备 1 抗原的提取和纯化 2 免疫动物或细胞融合 单克隆抗体 3 抗体效价检测和提取 4 标记抗体 B抗原的检测 1 细胞和组织切片的制备 2 免疫组织化学反应和显色 C观察和记录结果 二基本理论包括 1 抗原 抗体反应2 免疫标记化学反应3 呈色化学反应 第三节抗原与抗体的制备 1 抗原凡进入机体后能诱发机体产生一系列免疫反应 包括产生抗体和形成致敏的免疫细胞 并能与抗体或致敏细胞产生特异性反应的物质称为抗原 2 抗体是指机体在抗原的刺激下所产生的对抗抗原的特异性球蛋白 也称免疫球蛋白 按化学结构的特点可分为IgGIgDIgMIgAIgE五类 一抗原的提取 一 材料的选择及预处理 二 细胞的粉碎1 物理法a高速组织捣碎机b玻璃匀浆c超声波处理法d反复冻融法e冷热交替法2 化学和生物化学法a自溶法b溶菌酶处理法 三 抗原的提取1蛋白质和酶的提取2核酸的提取3活性多肽及递质的提取 四 抗原的分离与纯化1 蛋白质分离纯化的一些方法1 盐析法2 有机溶剂沉淀法3 等电点沉淀法4 吸附法 五 抗原的浓缩1 蒸发法2 冰冻法3吸收法二 免疫抗原的制备一 载体二 偶联剂三 制备过程 抗体的制备 一 抗血清的制备一 用于免疫的动物二 免疫途径三 佐剂四 免疫方法五 抗血清的采集与保存六 抗血清质量的评价1 效价指血清中所含抗体的浓度或含量 2 特异性测定3 亲和力 二 单克隆抗体的制备 一 动物的选择与免疫1 动物的选择2免疫方案1 可溶性抗原免疫抗原性较弱 需加佐剂 常用佐剂 福氏完全佐剂 福氏不完全佐剂 初次免疫 3周后 第二次免疫 3周后 第三次免疫 2 3周后 加强免疫 3天后 取脾融合 2 颗粒原免疫性强 不加佐剂 初次免疫 2 3周后 第二次免疫 3周后 加强免疫 融合前三天 取脾融合 二 细胞融合1 细胞融合前的准备 1 骨髓瘤细胞的选择 2 饲养细胞2 细胞融合的步骤 1 制备饲养层细胞 2 制备免疫脾细胞 3 制备骨髓瘤细胞 4 融合 三 选择杂交瘤细胞及抗体检测 四 杂交瘤的克隆化 五 杂交瘤细胞的冻存与复舒 六 单克隆抗体的大量生产 七 单克隆抗体的鉴定 第四节免疫组织化学技术的分类 一 根据标记物是否与特异性第一抗体结合分类1 直接法将标记物与第一抗体结合后 直接加到细胞或组织上 在适当条件下 抗体与抗原反应 2 间接法与 待检物 抗原特异性结合的第一抗体未被标记 而第二抗体以荧光素 酶或胶体金等标记 常用的标记物有荧光素和酶 荧光素标记的称为免疫荧光法 immunofluorescenttechnique 常用的萤光素有异硫氰酸荧光素 fluoresceinisothiocyanate 罗丹明 rhodamine 等 酶标记的称为酶标免疫法 enzyme labeledantibodymethod 常用的酶有辣根过氧化物酶 horseradishperoxidase 酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物 从而显示出抗原存在的部位 抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种 直接法是将带有标记的抗体与抗原反应 显示出抗原存在的部位 而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上 再用带标记的次级抗体同初级抗体反应 从而使初级反应得到放大 显示增强 二 根据标记物或呈色物的不同分类 一 免疫荧光法 二 免疫酶组织化学法 免疫酶组织化学法是抗原抗体的特异性与酶的高效催化作用相结合的一种免疫标记法 通过用酶标记抗原或抗体的示踪 对呈色反应后的有色化合物进行分光光密度的测定 可对免疫阳性产物做半定量的分析 此方法被广泛应用于医学和生物学的各个领域 其研究方法及分类如下 1 常用的标记酶1 辣根过氧化物酶 HRP 2 碱性磷酸酶3 葡萄糖氧化酶 2 非标记抗体免疫酶法将所用抗体均不做标记 利用二抗作为桥 将一抗和终抗体连接起来 其中终抗体为抗酶抗体 来自与一抗相同的动物种属 为将酶免疫动物后得到 目前最常用是未标记酶法是将桥抗体与一抗和标记的检测试剂复合物连接起来 后者包括氧化物酶 抗过氧化物酶复合物 碱性磷酸酶 抗碱性磷酸酶复合物以及抗生物素蛋白 生物素 氧化物酶复合物 1 PAP法 2 双桥PAP法 3 APAAP法 3 亲和免疫组织化学技术 1 抗生物素蛋白 生物素技术1 桥连抗生物素蛋白 生物素技术 BRAB 2 抗生物素蛋白 生物素 过氧化物酶复合法 2 葡萄球菌A蛋白法其能与某些动物IgG的Fc段非特异性结合 将SPA替代桥抗体 把酶 荧光素等标记在SPA上 标记的SPA就可直接检测组织细胞内的IgG成分或免疫化合物 3 凝集素法其具有与特定糖基专一结合的特性 用酶 胶体金等标记凝集素 利用其能与细胞糖基和细胞膜上的微细结构 4 酶标链酶抗生素蛋白 生物素法 LSAB 5 链酶抗生素蛋白 过氧化物酶法 SP 是根据链酶抗生素蛋白 过氧化物酶法连接系统设计应用于检测组织和细胞内抗原的一种高敏方法 4 放射自显影标记法 放射自显影术 radioautography autoradiography 用于研究标记化合物在机体 组织和细胞中的分布 定位 排出以及合成 更新 作用机理 作用部位等等 其原理是将放射性同位素 如14C和3H 标记的化合物导入生物体内 经过一段时间后 将标本制成切片或涂片 涂上卤化银乳胶 经一定时间的放射性曝光 组织中的放射性即可使乳胶感光 然后经过显影 定影处理显示还原的黑色银颗粒 即可得知标本中标记物的准确位置和数量 放射自显影的切片还可再用染料染色 这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定 这种技术与电镜样品处理 则为电镜放射自显影 由于有机大分子均含有碳 氢原子 故实验室一般常选用14C和3H标记 14C和3H均为弱放射性同位素 半衰期长 14C为5730年 3H为12 5年 一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷 3H TDR 来显示DNA 用3H尿嘧啶核苷 3H UDR 显示RNA 用3H氨基酸研究蛋白质 研究多糖则用3H甘露糖 3H岩藻糖等 5 胶体金法 用胶体金颗粒作为示踪物或探针标记抗体 利用抗原 抗体的特异性反应 从而对细胞内外的或细胞表面的多糖 糖蛋白 多肽 激素和核酸等生物大分子予以精确定位 第七章原位杂交组织化学 分子杂交技术 molecularhybridization 是在研究DNA分子复性变化基础上发展起来的一种技术 其原理是 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段 在适当条件下通过氢键结合 形成DNA DNA DNA RNA或RNA RNA杂交的双链分子 这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系 一 原位杂交 insituhybridization 用来检测染色体上的特殊DNA序列 最初是使用带放射性的DNA探针 通过放射自显影来显示位置 后来又发明了免疫探针法 将探针核苷酸的侧链加以改造 探针杂交后 其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别 从而显示出位置 图2 21 图2 21人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 来自http www ornl gov 二 Southern杂交 是体外分析特异DNA序列的方法 操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段 经凝胶电泳分离后 转移到醋酸纤维薄膜上 再用标记的探针杂交 通过放射自显影 即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列 第一节探针制备 一 探针的来源1 克隆分离2 建立基因文库3 人工合成4 反向合成二 探针标记1 同位素标记 1 缺口平移 或缺口翻译 标记法 2 末端标记法 适用于寡核苷酸探针的标记 3 随机引物法 2非同位素标记法 半抗原标记法最常用的是将地高辛连在NTP或dUTP上 或随机启动延伸法标记RNA或DNA探针 杂交后用羊地高辛抗体的Fab段与碱性磷酸酶的复合物检测 用NBT及X 磷酸盐显色 直接标记法将特定的酶或蛋白质直接标记RNA或DNA分子上 然后以酶促显色反应或特异性蛋白质染色做检测系统 生物素标记法将生物素用酶学方法或化学方法连接在核酸探针上 分子杂交后利用抗生物素对生物素具有高度亲和力的特性 用标记的生物素蛋白或链酶抗生素蛋白进行检测 第二节原位杂交的组织标本制作 冰冻切片新鲜组织取材后迅速骤冷 制成冰冻切片 石蜡切片一般用Bouin固定液固定组织 载玻片处理 第三节杂交组织化学反应 杂交前切片的预处理 杂交是核酸探针与组织或细胞内靶核酸以氢键方式通过互补碱基结合过程 两个单链RNA分子之间 单链DNA和RNA之间或两个单链RNA之间均可形成杂交体 杂交后处理与探针显示 第八章细胞分离技术 一 差速离心 differentialcentrifugation 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心 用于分离不同大小的细胞和细胞器 图2 22 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为 核 线粒体 溶酶体与过氧化物酶体 内质网与高尔基体 最后为核蛋白体 由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠 而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中 一般重复2 3次效果会好一些 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞 更多用于分离细胞器 通过差速离心可将细胞器初步分离 常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化 图2 22速度逐渐提高 样品按大小先后沉淀 图2 22速度逐渐提高 样品按大小先后沉淀 二 密度梯度离心 densitygradientcentrifugation 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度 将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部 通过重力或离心力场的作用使细胞分层 分离 这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种 图2 23 密度梯度离心常用的介质为氯化铯 蔗糖和多聚蔗糖 分离活细胞的介质要求 1 能产生密度梯度 且密度高时 粘度不高 2 PH中性或易调为中性 3 浓度大时渗透压不大 4 对细胞无毒 图2 23A等速度沉降 B等密度沉降 1 速度沉降 速度沉降 velocitysedimentation 主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器 这种降方法所采用的介质密度较低 介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度 生物颗粒 细胞或细器 在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离 2 等密度沉降 等密度沉降 isopycnicsedimentation 适用于分离密度不等的颗粒 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处 并停留在那里达到平衡 从而将不同密度的细胞或细胞器分离 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行 介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度 而且介质的梯度要求较高的陡度 不能太平缓 再者 这种方法所需要的力场通常比速率沉降法大10 100倍 故往往需要高速或超速离心 离心时间也较长 大的离心力 长的离心时间都对细胞不利 大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤 而且停留在等密度介质中的细胞比处在移动中的细胞受到更大的损伤 因此 这种方法适于分离细胞器 而不太适于分离和纯化细胞 二 流式细胞术 流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术 在分析或分选过程中 包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴 形成包含单个细胞的液滴 在激光束的照射下 这些细胞发出散射光和荧光 经探测器检测 转换为电信号 送入计算机处理 输出统计结果 并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群 分离纯度可达99 图2 24 包被细胞的液流称为鞘液 所用仪器称为流式细胞计 flowcytometer 图2 24用流式细胞计分选细胞 三 细胞电泳 在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷 能在外加电场的作用下发生泳动 这种现象称为细胞电泳 cellelectrophoresis 引起细胞电泳的电位值称为 电位 各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同 故在一定的电场中的泳动速度不同 在恒定的电场条件下 同种细胞的电泳速度相当稳定 因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的 电位 电位常因细胞生理状态和病理状态而异 因此在诊断疾病上有一定价值 此外由于不同类型的细胞在电场中的泳动速度不同 细胞电泳尚可用来分离不同种类的细胞 例如可把淋巴样细胞与造血细胞分开 第九章细胞培养与组织工程 一 细胞培养高等生物是由多细胞构成的整体 在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内 invivo 的功能活动是十分困难的 但是如果把活细胞拿到体外 invitro 培养进行观察和研究 则要方便得多 活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动 特别是高等动植物细胞要求的生存条件极其严格 稍有不适就要死亡 所以细胞培养技术 cellculture 就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术 动物细胞的生存环境与植物细胞差别很大 因而二者的培养方法很不相同 一 动物细胞培养 细胞培养方式大致可分为两种 图2 25 一种是群体培养 massculture 将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中 让细胞贴壁生长 汇合 confluence 后形成均匀的单细胞层 另一种是克隆培养 clonalculture 将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中 各个细胞贴壁后 彼此距离较远 经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落 称为克隆 clone 一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞 此外 为了制取细胞产品而设计了转鼓培养法 使用大容量的圆培养瓶 在培养过程中不断地转动 使培养的细胞始终处于悬浮状态之中而不贴壁 图2 25群体培养 左 和克隆培养 右 正常细胞培养的世代数有限 只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去 所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞 目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫HenriettaLacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成 此细胞系一直延用至今 1 原代培养 primaryculture 从动物机体取出的进行培养的细胞群 原代培养的细胞生长比较缓慢 而且繁殖一定的代数后 一般10代以内 停止生长 需要从更换培养基 将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养 Passage 2 细胞株 cellstrain 从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群 能够繁殖50代左右 在培养过程中其特征始终保持 3 细胞系 cellline 从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞 在培养条件下可无限繁殖 4 克隆 clone 亦称无性繁殖系或简称无性系 对细胞来说 克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群 二 植物细胞培养 植物细胞培养主要有如下几种技术 1 组织培养 诱发产生愈伤组织 图2 26 如果条件适宜 可培养出再生植株 用于研究植物的生长发育 分化和遗传变异 进行无性繁殖 制取代谢产物 2 悬浮细胞培养 在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术 适合于进行产业化大规模细胞培养 制取植物代谢产物 3 原生质体培养 脱壁后的植物细胞称为原生质体 protoplast 其特点是 比较容易摄取外来的遗传物质 如DNA 便于进行细胞融合 形成杂交细胞 与完整细胞一样具有全能性 仍可产生细胞壁 经诱导分化成完整植株 4 单倍体培养 通过花药或花粉培养可获得单倍体植株 经人为加倍后可得到完全纯合的个体 二 细胞融合 通过