（刘志明）科技创新项目结题报告书

项目类别项目批准号附件3 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称灵芝免疫调节蛋白基因在灰盖鬼伞中的表达研究 申 请 人： 刘志明 李昭萍 冯燕芬 所在院部： 食品学院 专业年级： 03级生物工程 联系电话：指导教师: 林俊芳 职称 教授 立项日期： 二五 年 四 月 三 日 结题日期： 二六 年 四 月 三 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 填 表 说 明 一、 填写结题报告书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。申请书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。 二 、申请书为A4复印纸，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原件），由指导教师和所在院（部）审查并签署意见后报大学生科技创新活动项目指导中心。三 、一级标题三号宋体加粗，用“一、二、三”标示；二级标题四号楷体加粗，用“（一）（二）（三）”标示；三级标题四号仿宋加粗，用“1、2、3”标示；四级标题四号仿宋，用“”标示。示例：一、XXXX课题立项与研究的目的意义（一）XXXX课题立项与研究的目的的意义1、XXXX课题立项与研究的目的意义XXXX课题立项与研究的目的意义四、如表格不够，可以加附页。一、简表项目简况项目名称灵芝免疫调节蛋白基因在灰盖鬼伞中的表达研究项目类别理科类；申请经费1500元起止年月2005-42006-4项目组成员姓 名性别出生年月年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字刘志明男1984-403生物工程一班食品学院78表达载体构建李昭萍女1984-503生物工程一班食品学院57.7遗传转化冯燕芬女1984-503生物工程一班食品学院69.9转化子鉴定指导教师情况姓名林俊芳性别男学位博士后职称教授研究方向微生物遗传育种授课名称食品生物技术进展，专业英语项目简介灵芝（Ganoderma lucidium）是担子菌纲多孔菌科灵芝属的真菌，中医认为灵芝是滋补强壮，扶正固本的珍品。灵芝免疫调节蛋白是灵芝来源的一类具有免疫调节活性的蛋白的统称。1989年日本学者Kino等人从赤芝（Ganoderma lucidum）菌丝体中分离到一种免疫调节蛋白，命名为LZ-8蛋白。Kino等人的研究还指出，该蛋白在体外具有凝集活性和促有丝分裂原活性，但并非植物凝集素；在体内主要表现为免疫抑制作用，能抑制系统性过敏反应和Arthus反应，以及能阻止糖尿病小鼠（NOD小鼠）胰腺炎的发生。Miyasaka N等人的研究发现，LZ-8能通过调节粘附分子而促进细胞间相互作用。Tanaka S等人的研究表明：LZ-8的氨基酸序列及预测的二级结构均与免疫球蛋白分子重链的可变区有很多相似性而表现出免疫调节作用，具有潜在的临床价值。 灵芝免疫调节蛋白在灵芝菌丝体中的含量约为：0.0174-0.0294，用传统的方法直接从菌丝体中提取生产的成本昂贵，不可能大量生产灵芝免疫调节蛋白。本研究拟将灵芝免疫调节蛋白导入灰盖灰盖鬼伞表达系统，大量表达灵芝免疫调节蛋白。同时进行下游工程相应配套技术的探索研究，为灵芝免疫调节蛋白大规模生产打下基础。二、项目研究的内容与方法一、研究内容（一）构建灵芝免疫调节蛋白载体。利用蘑菇gpd启动子与灵芝免疫调节蛋白基因连接构建灰盖鬼伞的表达载体；（二）灰盖鬼伞的转化与转化子的筛选：采用PEG法把表达载体和含有trpC基因的pLcc质粒共转化营养缺陷型的灰盖鬼伞原生质体质体中。在选择培养基上筛选鬼伞的转化子。 （三）1、灵芝免疫调节蛋白的分离纯化。通过离子交换层析，葡聚糖凝胶层析等方法获得高纯度灰盖鬼伞表达的灵芝免疫调节蛋白。 2、灵芝免疫调节活力检测。参照Kino等的方法进行蛋白免疫调节活性分析。 3、筛选高产菌株。挑选不同转化子，进行发酵培养和目的蛋白的分离，通过比较获得灵芝免疫调节蛋白高产菌株。二、具体方法详见附页灵芝免疫调节蛋白基因在灰盖鬼伞中的表达三、项目研究过程与资料查阅情况一、项目研究过程详见附页灵芝免疫调节蛋白基因在灰盖鬼伞中的表达二、资料查阅情况针对这个项目的内容和要求，我们主要查阅了以下资料：1、J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南（第三版）.科学出版社2、叶波平,王凡,梁亦馨,金国虔,吴梧桐. LZ-8 基因在大肠杆菌中的表达. 药物生物技术，2002 ,9 (1) :21233、林景卫，孙非，张韧，张春玉，刘立侠.真菌免疫调节蛋白研究进展.中国免疫学杂志，2005，21：4774804、刘建萍, 刘雪平. 灵芝免疫活性成分及其制剂的研究概况. 天津药学, 2004 ,12,16 (6)：43445、文磊，郑有顺.灵芝8-一种新的免疫调节蛋白.国外医学中医中药分册，1998，20(1):13156、吴丹，仇华吉，童光志. 几种表达系统的比较. 生物技术通报,2002：30347、叶波平，王庆华，周书进，金国虔，溪 寿，吴梧桐.灵芝免疫调节蛋白的分离及其活性研究.药物生物技术，2002，9（3）：1501528、王彦松,顾 明,赵杰东. 灵芝药用研究进展. 西南国防医药，2004，14（6）：680682四、项目成果完成形式和价值一、完成形式目前为止，整个课题项目的成果是，通过PCR技术的初步鉴定，筛选到若干个可能的灵芝免疫调节蛋白的转化子。二、项目价值灵芝免疫调节蛋白药理学研究表明：该蛋白具有多种免疫调节活性，如在体外具有凝集活性和促有丝分裂原活性，在体内主要表现为免疫抑制作用，能抑制系统性过敏反应和Arthus反应，以及能阻止糖尿病小鼠（NOD小鼠）胰腺炎的发生，通过调节粘附分子而促进细胞间相互作用等，具有潜在的临床价值。本项目研究的价值在于构建出能大量表达灵芝免疫调节蛋白的工程菌株，为以后该蛋白的工业化生产和大规模应用打下基础。五、经费使用情况一、试剂Taq酶 100u RMB229.50 购自Promega公司BsrG 500u RMB310.00 购自纽英伦生物技术有限公司Nco 200u RMB638.00 购自广州展晨生物科技有限公司Sal 1000u RMB210 购自北京赛百盛基因技术有限公司dNTP 1ml RMB675 购自北京天为时代科技有限公司DNA marker 50次/支 RMB90 购自北京天为时代科技有限公司注:1、超出学校提供的科技创新的经费支出,由教师的研究经费提供。2、其它实验过程中需用到的仪器、常规药品和材料，均由实验室提供。六、申请人对该项目研究工作完成后的认识总结在进行项目研究的过程当中，我有以下几点收获：1、运用促进学习，运用中深化对知识的理解，学以致用。2、扩大了关于本学科的知识面。3、提高了实际操作能力。4、加深了个人对本学科的理解，提高了本学科学习的兴趣。5、初步培养了个人的科学研究意识。七、指导教师对项目完成情况的意见 本课题组同学好学上进，团结互助，具有较强的