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蛋白质的分离纯化技术概述 汇报人 林辉2010年10月11日 蛋白质分离技术 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在 每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质 目前还没有一套单独 现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来 对任何一种蛋白质都有可能选择到一套适当的分离纯化程序以获得高纯度的制品 一般程序 前处理蛋白质的抽提蛋白质粗分级样品的分离纯化 前处理 分离提纯某一蛋白质 首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来 并保持原有的天然状态 不丧失生物活性 常用的破碎方法有 机械方法 如均浆喷射 研磨或超声波化学法 如去污剂 有机溶剂处理酶学方法 如溶菌酶处理 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲溶液把蛋白质提取出来 抽提所用缓冲溶液的PH值 离子强度 组成成分等应根据目的蛋白质的性质而定 蛋白质粗分级 采用分级盐析 等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法将目标蛋白质与其他蛋白质分离开来 样品的分离纯化 样品经粗分级后 采用层析法如凝胶过滤 离子交换层析 吸附层析 亲和层析等 进行分离纯化 也可以进一步选择电泳法作为最后的提纯步骤 蛋白质分离纯化的常用方法 分离和提纯蛋白质的各种方法 主要是利用蛋白质之间的各种特性差异 根据分子大小不同的分离方法 透析和超滤 利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质 使蛋白质和其他小分子物质如无机盐 单糖 水等分开 离心分离 利用物质沉降系数 质量 形状及密度的不同 凝胶过滤层析 利用凝胶介质交联度或者孔度 网孔大小 来决定凝胶的分级范围 利用溶解度差别的分离方法 等电点沉淀和PH值控制 等电点时蛋白质的净电荷为零 溶解度最低 蛋白质的盐溶和盐析 中性盐对球状蛋白质的溶解度有明显影响 有机溶剂分级法 与水互溶的有机溶剂 甲醇 乙醇和丙酮等 能使蛋白质在水中的溶解度显著降低 在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性 如果预先将有机溶剂冷却到 40 C以下 然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂 那么变性可以得到很大程度缓解 根据蛋白质的吸附性质分离 某些物质 如极性的硅胶和氧化铝以及非极性的活性炭等 具有吸附能力 能够以不同强弱的吸附力吸附蛋白质 吸附层析法就是利用这种吸附力的强弱不同而达到分离的目的 根据对配基的生物学特异性分离蛋白质 亲和层析 根据蛋白质能够特异性地与另一种配基非共价结合而提出的亲和层析 是一种针对性最强的蛋白质分离方法 配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子 原子团 分子 如酶的作用底物 辅酶及其结构类似物 根据蛋白质带电状态分离 离子交换层析IEC是根据蛋白质的两性解离性质 在溶液中所带电荷不同进行分离的 离子交换层析介质一般是大孔径亲水凝胶介质
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