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基因工程 郑州大学生物工程系主讲教师 刘红涛 第二章DNA重组 DNA重组的概念及意义 在自然界 生物体内时刻发生DNA的重组 呈现出对生物有利或有害的变异 这种重组不受人们意志控制 重组结果难以预测 基因工程涉及的DNA重组是根据人们的愿望 进行严密的设计 在生物体外通过人为的DNA片段化的重新连接 产生新的重组DNA分子 使其遗传信息发生变化 达到人们希望的目的 2 1DNA的组成和结构 略 2 2天然DNA的制备 2 2 1天然DNA的来源和用途 2 2 2天然DNA的提取 准备生物材料 裂解细胞 分离和抽提DNA 1 准备生物材料选择生物种类 选择DNA易提取和含量高的组织 选择DNA得率最高的生长期 如 大肠杆菌质粒DNA 应在对数生长期后期 植物DNA 选幼嫩植株或黄化幼苗 减小淀粉对提取DNA的干扰 肝脏DNA 要清除胆囊 主要是去除多种高活性的酶 2 裂解细胞这步是关系到能否提取到DNA以及DNA得率高低和质量的关键步骤 原核细胞 用溶菌酶 NaOH和SDS 煮沸 冰冻 超声波等方法 结构复杂的动 植物材料 先必须粉碎 液氮冻结后研磨 或捣碎机 研钵直接粉碎 再参照裂解原核的方法 3 分离和抽提DNA提取总DNA 在裂解液中加适量酚 氯仿 异戊醇或氯仿 异戊醇等有机溶液 使DNA与蛋白质分开 用乙醇或异丙醇沉淀DNA 再离心 提取叶绿体或线粒体等细胞器DNA以及病毒和噬菌体的DNA 须先从裂解液中分离完整细胞器 病毒和噬菌体 抽提前必须经DNase处理 水解附着于其表面的其它DNA 提取质粒DNA 调节裂解液pH12 6 所有DNA都变性沉淀 再调节PH至中性 质粒DNA复性后从沉淀物中释出 除RNA 用RNase水解除RNA 分离抽提DNA最有效的方法 氯化铯梯度离心 氯化铯溶液中加适量溴化乙锭 紫外灯下DNA带和RNA带都发荧光 但沉降系数明显不同而聚集于不同的氯化铯密度区 2 2 2 1大肠杆菌源质粒DNA的提取碱裂解法 原理 细菌悬浮液暴露在高pH值的强阴离子洗涤剂中 会使细胞壁破裂 染色体DNA和蛋白质变性 相互缠绕成大型复合物 被SDS包盖 当用钾离子取代钠离子时 复合物会从溶液中有效地沉淀下来 离心去除后 就可从上清中回收质粒DNA 实验步骤挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养 用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml含有相应抗生素的LB液体培养基中 于37 剧烈振摇下培养过夜 将1 2ml培养物倒入微量离心管中 于4 以5000g离心5min 两次 吸取并弃去培养液 使细菌沉淀尽可能干燥 将细菌沉淀重悬于100 l溶液 中 剧烈振荡 加200 l溶液 盖紧管口 快速颠倒离心管5次 以混合内容物 确保离心管的整个表面均与溶液 接触 不要振荡 将离心管放置与冰上5min 加150 l溶液 盖紧管口 将管倒置 温和振荡20s 使溶液 在黏稠的细菌裂解液中分散均匀 之后将管置于冰上5min 4 离心12000g 5min 上清转移至另一离心管中 加等体积酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 振荡混匀 4 离心12000g 5min 上清转移至另一离心管中 用2倍体积无水乙醇于室温沉淀质粒DNA 振荡混匀 于室温放置2min 4 离心12000g 5min 小心吸去上清夜 将离心管倒置于一张纸巾上 以使所有液体流出 再将附于管壁的液滴除尽 用1ml70 乙醇溶液洗涤沉淀 4 离心12000 5min 弃去上清 在空气中使核酸沉淀干燥 用50 l含无DNA酶的胰RNA酶 20 lg ml 的TE重新溶解核酸 振荡 贮存于 20 试剂 1 溶液 50mmol l葡萄糖25mmol lTris HCl pH8 0 10mmol lEDTA Na2 pH8 0 5mg ml溶菌酶 临用时加 2 溶液 新鲜配制 200mmol lNaOH1 W V SDS 3 溶液 100ml 5mol lKAc60ml冰乙酸11 5ml pH4 8 ddH2O28 5ml 2 2 2 2 噬菌体DNA的提取溶源周期溶菌周期提取 DNA的原理 先将溶源菌培养至一定密度 通过热诱导 使 DNA从宿主染色体DNA上释放出来 再经过溶菌周期培养 获得大量 噬菌体 从中提取线形的 DNA 提取过程 溶源菌诱导培养分离 噬菌体 DNA的提取 2 2 2 3氯化铯法制备植物基因组DNA材料准备细胞裂解DNA分离抽取 2 2 3DNA的纯化2 2 3 1氯化铯 溴化乙锭连续梯度离心法2 2 3 2离子交换层析法用三烃甲基氯化铵层析树脂纯化DNA用羟基磷灰石纯化DNA2 2 3 3琼脂糖凝胶电泳洗脱法2 2 3 4 基因纯 试剂纯化2 2 3 5从DNA样品中去掉EB正丁醇 或异戊醇 抽提法Dowex树脂层析法 2 2 4DNA的浓缩乙醇沉淀法含一价阳离子的DNA溶液 2体积无水乙醇 沉淀DNA 离心 溶于适量TE缓冲液或无菌水 条件 20 30min以上 小于1kb或量较少时 于 70 沉淀 或延长时间 正丁醇抽提法DNA溶液 1体积正丁醇 混匀 离心 1600r min1min 弃上清 重复至所需体积 用水饱和乙醚抽提DNA溶液两次 除正丁醇 空气中蒸发乙醚 聚乙二醇浓缩法DNA溶液 透析袋 置高浓聚乙二醇溶液 4 浓缩至所需体积 2 3限制性核酸内切酶和DNA片段化 2 3 1限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease 定义是一类能识别双链DNA中特殊的核苷酸序列 并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶 类型 型限制酶 型限制酶 型限制酶 EcoRI GAATTCCTTAAG 1 型限制酶 无用 分子量 30万dal左右组成 3种亚基特异性亚基 具特异性识别DNA序列的特性 修饰亚基 具甲基化酶活性 限制亚基 具核酸内切酶活性 辅助因子 需Mg2 ATP和SAM 即S 腺苷甲硫氨酸 识别和切割位点 不一致 距识别位点5 一侧数千碱基处随机切割DNA分子 2 型限制酶 十分有用 分子量 2万 10万dal 较小 组成 一种多肽 常以同源二聚体形式存在 辅助因子 无需辅助因子 或只需Mg2 识别和切割位点 有较为专一的识别位点 3 型限制酶 无用 组成 两个亚基M亚基 负责位点的识别与修饰 R亚基 具核酸酶的活性 辅助因子 需Mg2 ATP和SAM识别和切割位点 不一致 距识别位点3 端约25bp处切割DNA分子 限制酶的命名 型限制酶的特性1 不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列 6个 大多数 如EcoR 5 GAATTC 3 识别序列 6个 如Asu 5 GGNCC 3 5个 Mbo 5 GATC 3 4个 6个 如Not 5 GCGGCCGC 3 8个 有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内 如 Sau3A识别 GATCBamH 识别 GGATCC 有的限制酶识别多种核苷酸序列 如 Hind 识别4种核苷酸序列 5 CTPyPuAC 3 Py 嘧啶碱基C或T Pu 嘌呤碱基A或G 2 各种限制酶的识别序列一般都具有回文结构 类限制酶识别序列特点 回文结构 palindrome GGATCCCCTAGG 5 3 5 3 限制酶 BamH 正读与反读都相同 以识别序列的中线为对称轴 左右两侧的碱基互补 为便于书写 识别序列可以以5 3 走向的单链DNA表示 3 各种限制酶的切割类型是各式各样的 切割后形成各种粘性末端或平整末端 1 粘性末端和平整末端 a 5 P单链延伸的粘性末端 b 3 OH单链延伸的粘性末端 粘性末端 粘端 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 如 EcoR 5 3 5 3 5 3 5 3 CTGCAG GACGTC 5 3 5 3 5 3 5 3 平头末端 平端 CCCGGG GGGCCC 5 3 5 3 5 3 5 3 2 两种特殊的限制酶 同尾酶和同裂酶 同尾酶 isocaudamer 有些限制性内切酶虽然来源各异 识别的靶序列也各不相同 但切割DNA后 产生相同的粘性末端 这一类限制酶特称为同尾酶 这两个相同的粘性末端称为配伍未端 BamH Bgl 同裂酶 isoschizomer 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列 这类酶特称为同裂酶 同裂酶的切点位置可相同或不同 BamH Bst a 切点位置相同 b 切点位置不相同 4 某些限制酶在非标准反应条件下 可能导致酶的识别序列特异性发生改变 限制酶的第二活性 在甘油浓度 离子强度 pH值 有机溶剂 二价阳离子 酶与DNA的比例等参数单独或同时发生改变时 会导致限制酶的识别序列特异性发生改变 在DNA内产生附加切割 称为限制酶的第二活性 又称Star活性 能产生第二活性的酶常在酶名称的右上角加一星号 如EcoR 2 3 5限制性核酸内切酶反应系统反应系统包括 酶 底物 反应缓冲液 合适的反应温度等 2 3 5 1底物DNA限制酶的催化效率与DNA样品纯度 DNA分子构型 识别序列两侧序列长短以及序列碱基甲基化等密切相关 DNA纯度 DNA分子构型 识别序列侧面的序列 保护碱基 如EcoRI GAATTC 位点偏爱 DNA甲基化 2 3 5 2限制性核酸内切酶用量主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品1酶活性单位 U 某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下 60min内完全切割1 g DNA所需的酶活性 酶活性高的用量少 反之则多 能被高效切割的DNA样品用酶量少 反之则多 等量的两种DNA样品 限制酶识别序列密度大的用酶量多 反之则少 2 3 5 3限制性核酸内切酶反应缓冲液包含 氯化镁或醋酸镁 氯化钠或醋酸钾 二硫苏糖醇 DTT 或 巯基乙醇 2 Me Tris HCI或Tris Ac 2 3 5 4限制性核酸内切酶反应温度大多数的最适反应温度是37 而少数酶的最适反应温度高于或低于37 2 3 6限制性核酸内切酶的Star活性 见前 几乎所有的限制酶都具有Star活性 Star活性的影响 导致切割中出现非特异性DNA片段 甚至不能获得预计的DNA片段 影响进一步的DNA连接重组 排除方法 如降低反应系统中甘油含量 控制pH中性和高盐浓度下进行反应 2 3 7DNA分子片段化天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段 即DNA分子的片段化 常用的切割方法有单酶切 双酶切和部分酶切等方法 单酶切法 用一种限制性内切酶切割DNA样品 最常用 双酶切法 用两种不同的限制酶切割同一种DNA分子 部分酶切 指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割 EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI 1 2 3 4 2 3 8DNA分子的限制性图谱 2 4特异性DNA片段的PCR扩增 聚合酶链式反应 polymerasechainreaction 即PCR技术 由美国科学家Mullis于1983年发明 又称基因的体外扩增法 也有人称无细胞分子克隆法 PCR技术的用途目的基因的扩增与分离 医疗诊断 基因突变与检测 分子进化研究 环境检测 法医鉴定 1PCR的基本原理 一 基本原理 Tm 4 G C 2 A T 90 95 30 1 37 60 30 1 70 75 30 2 预变性5min 目的 1 破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构 使DNA充分变性 减少DNA复杂结构对扩增的影响 以利于引物更好的和模板结合 特别是对于基因组来源的DNA模板 最好不要吝啬这个步骤 2 此外 在一些使用热启动Taq酶的反应中 还可激活Taq酶 从而使PCR反应得以顺利进行 二 长产物片段 和 短产物片段 短产物片段 是严格地限定在两个引物链5 端之间的 正是需要扩增的特定片段 长产物片段 则带有不需要的 尾巴 短产物片段 是按指数倍数增加的 而 长产物片段 则以算术倍数增加 几乎可以忽略不计 三 平台效应在PCR反应中 当引物 模板与DNA聚合酶达到一定比值时 DNA聚合酶催化的反应趋于饱和 会出现 平台效应 即PCR反应产物不再增加 平台效应出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数 所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等多种因素 2PCR反应条件的优化 一 标准PCR反应流程 一 反应体系标准PCR反应体系为50 100 l 其中包含 1 PCR反应缓冲液4种dNTP 各200 M两种引物 各0 25 MDNA模板 0 1 gTaqDNA聚合酶 2U 二 反应步骤 二 PCR反应条件的优化特异性 有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标 PCR反应的主要影响因素有 一 循环参数 反应温度与时间 变性退火延伸循环次数 二 PCR反应成份TaqDNA聚合酶引物dNTP缓冲液模板其它因素高温启动添加剂 3引物的设计 一 设计原则PCR扩增引物 是指与待扩增DNA区域两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段 其长度通常在15 30个核苷酸之间 它包括引物1和引物2 引物1 又称Watson引物 是5 端与正义链互补的寡核苷酸 用于扩增编码链或mRNA链 引物2 又称Crick引物 是3 端与反义链互补的寡核苷酸 用于扩增DNA模板链或反密码链 引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性 同时尽可能抑制非特异性扩增 具体的设计原则见书P57 二 引物长度引物太短 可能同非靶序列杂交 得出非预期的扩增产物 引物过长 引物同模板DNA的杂交速率下降 结果在反应循环周期内无法完成同模板DNA的完全杂交 从而减低PCR反应的效率 三 引物的5 端修饰法5 端附加核酸序列 加酶切位点等 功能基团修饰法放射性核素 修饰三磷酸 非放射性分子 修饰碱基 如用Dig Biotin等 4耐热DNA聚合酶 一 TaqDNA聚合酶热稳定性无3 5 外切酶活性反转录活性非模板依赖的聚合活性影响酶活性的因素 二 其它耐热DNA聚合酶 见书P56 PwoDNA聚合酶TthDNA聚合酶C therm 聚合酶ventDNA聚合酶 PfuDNA聚合酶 2 5DNA片段的化学合成 2 5 1寡核苷酸片段的化学合成的方法磷酸二脂法磷酸三脂法固相亚磷酸三脂法 常用 见60 66页 2 5 2化学方法合成的DNA片段化学方法可合成DNA互补链的引物 寡核苷酸连杆以及基因片段和元件等 合成DNA互补链的引物除PCR引物外 还有测序引物 见下表 DNA寡核苷酸连杆 linker linker 是指用化学方法合成的一段由10 20个核苷酸组成 具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段 linker经限制酶切割后可产生一定的粘末端 可与另一有相同粘末端的DNA片段连接 附图 化学合成的寡核苷酸中 有的含有一个反向重复序列而形成一个双链发夹结构 在双链部分有一种限制性核酸内切酶的识别序列 切割后产生一定的粘末端或平末端 这种寡核苷酸可兼作连杆和引物 即测序引物连杆 由几十至上百个核苷酸组成 有多种限制酶的识别序列 可作为连杆且被组装在克隆载体上成为多克隆位点 MCS 这种连杆即多克隆位点寡核苷酸连杆或简称MCS连杆 附图 衔接头 adaptor adaptor 它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段 附图 DNA芯片DNA芯片 是DNA片段以预先设计的排列方式固定在载玻片或尼龙膜上组成的密集分子排列 2 6DNA片段大小的凝胶电泳检测 方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖 聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳等方法 条件 中性或偏碱性的缓冲系统 DNA带负电 运动方向 DNA经过凝胶分子筛移向正极 迁移率影响因素 DNA分子的大小和构型 与DNA碱基组成和顺序无关 检测 溴化乙锭染色 紫外光下发红色荧光 2 6 1琼脂糖凝胶电泳参数凝胶缓冲液和电泳缓冲液常用 TAE 使用广泛 缓冲容量小 TBE 缓冲能力强 长时间电泳 TPE 缓冲能力也较强 但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出 所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用 凝胶中琼脂糖含量检测大片段DNA的含量小 反之则大 加DNA样品一般1 g以下 多了会使大小接近的DNA带不易分开 少了会影响小片段DNA带的检测 电泳条件注意 靠加样孔一侧为负极 电压 1 10V cm 依据分辨力要求 DNA片段大小和电泳时间决定 溴化乙锭 EB 染色和紫外观察注意 溴化乙锭是很强的诱变剂 操作时应带手套 溴化乙锭溶液必须经处理后才能废弃 2 6 2DNA片段 分子 大小的估算将待测DNA片段直接与Marker比较 通过Marker的相对迁移距离 推测出待测DNA片段的大小 MCK123456 bp20001000750500250100 2 6 3非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳参数制胶的电泳缓冲液 90nMTris 硼酸缓冲液凝胶丙烯酰胺含量 按表2 24进行加DNA样品 加样孔一端为上方 上下电泳槽加入电泳缓冲液 凝胶要完全接触电泳缓冲液 接触处不得有气泡 电泳条件 缓冲液槽在上方为负极 下方为正极 电压5V cm 室温 EB染色和DNA片段大小估算 同琼脂糖凝胶电泳 2 6 4脉冲场凝胶电泳 CHFE 参数缓冲液 TBE或0 5 TBE 蠕动泵驱动循环 凝胶 用0 5 TBE制备的琼脂糖凝胶按图2 16装入电泳槽 加入电极缓冲液 超过凝胶2 3 加入DNA样品电泳条件 交替改变的电场力 由编程转换装置控制脉冲参数 DNA的EB染色DNA片段大小 分子 的估算 可检测几百万bp的DNA片段 脉冲场凝胶电泳分离片段大小及迁移速度的经验公式见表2 25 2 7DNA片段的连接重组 2 7 1DNA连接酶 DNALigase DNA连接酶 是在1967年发现的一种能够催化双链DNA片段紧靠在一起的3 羟基端与5 磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键 使两末端连接起来的酶 如果是两个或两个以上不同的双链DNA片段末端连接 则产生重组DNA分子 连接酶的主要类型 E coliDNA连接酶T4DNA连接酶 DNA连接酶连接作用的特点 DNA连接酶需要一条DNA链的3 末端有一个游离的羟基 OH 另一条DNA链的5 末端有一个磷酸基 P 的情况下 才能发挥连接DNA分子的作用 只有当3 OH和5 P彼此相邻 并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时 DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键 DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子 被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分 DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口 nick 而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口 gap 由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应 因此 DNA连接酶在进行连接反应时 还需要提供一种能源分子 NAD 或ATP 2 7 1 1E coliDNA连