IgG的纯化.doc

Ig G的纯化产品编号：AG-0011 AG-0012包装规格：10mg/支 50mg/支来 源：从动物血清中纯化获得 产品外观：白色冻干粉末储 存：20冻存一 方法：离子交换色谱法二 材料：DEAE-纤维素 色谱柱所用试剂配制：0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液 NaH2PO42H2O 15.60g 加H2O至 1000mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液 Na2HPO412H2O 35.80g 加H2O至 1000ml取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。0.06mol/L PH5.0 的乙酸缓冲液乙酸 0.51ml乙酸钠三水 2.872g加H2O至 1000ml三 操作流程3.1免疫球蛋白上柱前的处理:15ml 血清+2倍体积的0.06mol/L PH5.0 的乙酸缓冲液2用0.1mol/L Hcl 调PH到4.5 3室温搅拌，在30min内逐滴缓慢加入辛酸。（羊血清70ul/ml，人血清70ul/ml， 兔血清75ul/ml，小鼠血清40ul/ml，小鼠腹水33ul/ml）44度静置2h，12000转/min 离心30min5取上清过滤，加入1/10体积的0.1mol/LPB，PH7.4 ( 含8.5%Nacl ) 6室温搅拌，在30min内加入硫酸铵达45%（0.277g/ml）74度下静置1h，12000转/min 离心30min8弃上清，沉淀溶于适量含137mMNacl，2.6mMKcl，0.2Mm EDTA 的0.01mol/L的 PB中9装入透析袋中对上述PB在 4度透析过夜3.2 柱料的处理：称取所需DEAE-纤维素用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。 0.5 M NaCL（介质体积5-10倍）漂洗，以使颗粒均匀。 0.5-1 M HCL（介质体积5-10倍）处理，去除酸液，再用水洗成中性。 1M NaOH（介质体积5-10倍）处理，去除碱液，再用水洗成中性。3.3 装柱：将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。层析柱中加入洗脱液（0.01M PH 7.4 PB），打开下口螺旋夹，让溶液流出，排除残留气泡，最后保留约2厘米高度的洗脱液，拧紧螺旋夹。将DEAE-纤维素轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待柱料沉积到柱床下已超过l厘米时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到8厘米,关闭出口。装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。3.4 上样：上样前，先用缓冲液（0.01M PH 7.4 PB）平衡l至2个柱床体积，柱料面上始终保持有一定的洗脱液，等到紫外分析仪读数显示95稳定后上样。上样量应小于柱床体积的20%即1g蛋白/10g纤维素。3.5 洗脱： 上样完毕，用缓冲液（0.01M PH 7.4 PB）洗脱第一蛋白峰（流速1ml/min），当读数显示40时接取样品。 继续洗脱，读数下降为10时，用0.01M-0.05M PH 7.4 PBS洗脱第二蛋白峰。 合并1、2蛋白峰即纯化后的IgG.。 用0.01.M-2M PBS洗脱杂蛋白峰。3.6 柱子的再生和柱料的清洗、储存：用过的离子交换剂可以反复使用，使其恢复原状的方法俗称“再生”。再生并非每次用酸、碱反复处理，通常只要“转型”处理即可。所谓转型就是使交换剂带上所希望的某种离子，如希望阳离子交换剂带上NH4+则可用NH4OH浸泡，如希望阴离子交换剂带上Cl则用NaCl溶液处理。本实验中DEAE纤维素在酸碱处理后，用0.01mol/L，pH7.4磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型，以HPO4-取代DEAE中的OH。一般由于DEAE纤维素使用后因带有大量杂蛋白，所以再生时，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用无离子水洗至pH8左右，再转型，即可再使用。3.7 IgG的纯度鉴定SDS- PAGE电泳：在还原变性条件下( SDS- PAGE) 鉴定纯化后的IgG 样品。SDS- PAGE 电泳分离胶浓度为12% , 浓缩胶浓度为5 % , 蛋白Marker分子量标准为14 .4 116 .0 kD。若血清IgG 的SDS- PAGE 图谱中只存在2 条蛋白条带, 一条重链分子量约为为50 kD左右, 轻链分子量为25 kD左右，没有杂带。则表明获得高纯度的