抗体工程重点.docx

精品文档第二章 抗体的结构与功能 * 重点章节。（一个名词解释）1、（Ab）：抗原剌激机体后，由浆细胞产生的并能与抗原发生特异性结合的球蛋白。免疫球蛋白（Ig）：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白3.功能区：Ig分子的H链和L链可通过链内二硫键折叠成若干个球形结构，每一个球形结构由110个氨基酸组成，具有一定的生理功能，称为功能区。又叫结构域。4.变异度（variability):某一位置的变异度为该位置出现的不同氨基酸数与该位置最常出现的氨基酸残基的出现频率之间的比值 。5、免疫球蛋白超家族immunogloblin superfamily IGSF ：含有免疫球蛋白折叠结构样功能区的分子。Ig分子超家族的成员多数为细胞膜表面分子6、按免疫球蛋白抗原特性分类：1）同种型：指同一物种内所有个体的抗体共同具有的抗原特异性，存在于恒定区。同种型抗原特异性因种属而异，主要包括Ig的类、亚类，型和亚型。2）同种异型：是指同一种属不同个体间Ig分子所具有的不同抗原特异性。可作为遗传标记，存在Ig的恒定区。3）独特型：每一个抗体形成细胞克隆所产生的抗体分子上所特有的抗原特异性。由VH或VL可变区氨基酸序列的不同所决定。 与抗体结合抗原的特异性密切相关。 7、CDR表位：VH和VL紧密地结合在一起，形成一个致密的球状结构，成为Fv段，6个CDR襻位于Pv段的N端，叫做CDR表面(CDR surface)，即抗原结合部位。8、结合力：抗原抗体的结合依靠静电引力、氢键、范德华力等，需要合适的温度、pH、离子强度及完整的抗体，这种结合是可逆的。9、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC) ：抗体分子与靶细胞表面抗原结合后，可通过其Fc段与杀伤细胞表面的Fc受体相结合，促进对靶细胞的杀伤作用，称为ADCC。单核巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞第三章 多克隆抗体（一个简答）1、多克隆抗体的概念传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同免疫途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可 以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物, 所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体。2、抗体应答反应中初次应答和记忆应答的各自的特点。初次应答：潜伏期长。抗体类型最早产生IgM，接着才产生IgG，2w2m才产生IgA。抗体总量低。维持时间短。亲和力弱。记忆应答：潜伏期短。抗体类型IgG为主，IgM很少。抗体总量高。维持时间长。亲和力强。3、免疫佐剂：（概念、作用、主要类型）概念：先于抗原或与抗原混合同时注入动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用的物质，被称为佐剂或免疫佐剂。生物学作用：1、增加抗原的免疫原性 2、提高抗体的滴度（抗体的滴度其实也就是抗体的浓度 ）3、改变抗体的类型IgMIgG 4、引起或增强迟发型超敏反应佐剂的作用方式：在接种部位形成抗原贮存库增加抗原的表面积促进局部的炎症反应主要的免疫佐剂的类型：无机佐剂；乳化油剂；微生物极其代谢产物；人工合成佐剂；生物分子类。4、蛋黄抗体IgY：概念：是指蛋黄中存在的抗体，也称蛋黄免疫球蛋白特点：IgY化学性质稳定。抗体产量大。成功率高。应用：作为抗生素的替代品，用于畜禽疾病的预防和治疗。酶和激素的IgY：尿酶的IgY、胆囊收缩素抗体。新的饲料添加剂。第四章 单克隆抗体（*重点章节。考一个论述）1、原理：一个淋巴细胞只接受一个抗原决定簇刺激及经刺激后扩增的淋巴细胞产生均一的同质抗体，此即单克隆抗体技术的理论基础。2定义：由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆所产生的结构与功能完全相同的同源抗体。3、单克隆抗体的应用。A生命科学研究：蛋白质组学研究领域（人类蛋白质组计划）；细胞抗原研究及鉴定分类（人类白细胞分化抗原、淋巴细胞亚群分类、淋巴细胞亚群分离纯化）；细胞受体研究（受体的分离纯化、细胞定位、结构研究、功能分析）；B疾病诊断与治疗：感染性疾病诊断（检测病原体微生物的抗原、对各类病原体的分型及鉴定）；肿瘤诊断及预后判断（检测血液中的肿瘤标志物）；其它诊断及研究疾病治疗（生物导弹 治疗性抗体）4、单抗制备的实验方案。A融合前的准备工作：组织培养材料的准备(设备 组织培养用水 培养基 血清 抗生素)；小鼠免疫（抗原 动物选择 免疫途径 载体）B细胞融合：骨髓瘤细胞的选择（生化缺陷型骨髓瘤细胞系NS1细胞株，SP2/0细胞株。）骨髓瘤细胞的培养（细胞处于对数生长期；形态和活性佳（活性大于95）；约需1108个骨髓瘤细胞；融合前用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养。）骨髓瘤细胞悬液的制备脾细胞悬液的制备饲养细胞的制备细胞融合与选择性培养C杂交瘤细胞的筛选：显微镜观察确定待筛选孔。换液后，细胞在37、5CO2培养箱中培养2天以上。从要检测的孔中取100l上清用于检测，如 ELISA，间接免疫荧光等。D杂交瘤细胞的扩增、冻存和克隆化：a克隆化：使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。（将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。有限稀释法）b 冻存：细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度，可在-196液氮或液氮蒸气中长期保存。冻存的杂交瘤细胞应处于对数生长中期、健康而活力好。c 细胞的复苏E单克隆抗体的大量制备 ：制备杂交瘤培养上清；大规模制备杂交瘤培养上清；制备单克隆抗体腹水；单克隆抗体的纯化（粗提 纯化）。第五章 基因工程抗体（一个名词解释，一个简答）1、基因工程抗体：是指根据不同的目的和需要，利用DNA重组技术或蛋白质工程技术，在基因水平上对抗体分子进行加工、改造和重组装配，然后导入受体细胞进行表达产生的抗体分子。也称第三代抗体。2、基因工程抗体的优点：（1）通过基因工程技术的改造，可以最大程度降低抗体的鼠源性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反应。（2）基因工程抗体的分子较小，穿透力强，更易到达病灶的核心部位。（3）可以根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体。（4）可以采用原核细胞、真核细胞或植物等多种表达系统大量生产抗体分子，成本大大降低。 3、各种类型基因工程抗体的特点，应用、优缺点。（分为以下7个问题）（1）嵌合抗体：可变区基因克隆的方法：用探针从该杂交瘤细胞系的基因组文库中钓取；用RT-PCR方法从该细胞的mRNA中扩增VH及VL基因。嵌合抗体的表达（提高表达量的方法）：二氢叶酸还原酶（dhrf）扩增系统：CHO的显性选择标记基因转染阳性细胞筛选甲氨喋呤dhfr基因扩增抗体基因扩增抗体表达量提高（2）改形抗体：改形抗体构建的原则？A在选择骨架区时，从已知的人可变区数据中选择与亲本抗体同源性最高的序列，这样就最大可能的维持原抗体的天然构象。B将骨架区内可能影响抗原结合部位的氨基酸残基替换为亲本鼠单抗的残基C合适的保留CDR两侧的骨架区序列D抗体可变区的N末端特别是轻链的N末端与CDR表面相距很近，这一区域很有可能参与抗原的结合，所以构建改形抗体时，有必要选择性地将N末端的数个氨基酸残基一起移植。（3）抗体库技术人源化：抗体表位定向选择，概念和基本过程。概念：以鼠单抗可变区为模板，利用噬菌体展示技术，通过抗原导向，筛选能够模拟鼠单抗可变区，结合相同抗原决定簇的人抗体，称为抗原表位定向选择（EGS)。过程如下：优点：可以获得完全的人源抗体缺点：成功率不高，所或抗体性能也难以保证 （4）小分子抗体：各种小分子抗体的概念和构成。定义：具有抗原结合功能的小分子片段，称为小分子抗体。包括：抗原结合片段（Fab)、可变区片段（Fv)、单链抗体(ScFv）和单区抗体等。1、 抗原结合片段（Fab)：完整的轻链和Fd组成；分子结构稳定；主要发挥抗体的抗原结合功能；仅有一个抗原结合位点；分子量50kDa；无Fc段，适合免疫导向诊断和治疗2、 变区片段（Fv)：由重链可变区VH和轻链可变区VL组成。3、单链抗体(ScFv）：在DNA水平用一段长度合适的寡聚核苷酸序列将重链可变区和轻链可变区连接起来，形成单一链的分子。相对分子量较小，仅为完整抗体的1/6。4、单域抗体：约为完整分子的1/12。只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体亲和力降低，但保持原单抗的特异性。分子小，抗原性弱；易于穿透组织。 （5）单链抗体的基本原理和构建流程。基本原理：在DNA水平用一段长度合适的寡聚核苷酸序列将重链可变区和轻链可变区连接起来，形成单一链的分子。构建流程：鼠杂交瘤细胞提取细胞总RNA反转录为cDNA第一链扩增抗体VH、VL基因用（Gly4Ser）3连接肽基因将VH、VL连成ScFv基因PCR扩增ScFv基因并与质粒载体连接连接产物转化大肠杆菌宿主，筛选阳性克隆ScFv全序列的测定（6）小分子抗体的优缺点优点：A免疫原性弱，不易引起HAMA；B穿过血管壁或组织屏障进入病灶部位；C肿瘤内定位成像时本底低，图像清晰；D半衰期较短,造影时对周围的组织损伤小；E制备流程简单，可原核表达，制备成本低,容易大量制备；F易于进一步进行基因工程改造。缺点：多为单价，抗原结合能力较弱；半衰期较短，很快从血液中清除，影响治疗的有效浓度。（7）双特异性抗体和抗体融合蛋白：定义、应用A抗体融合蛋白：抗体分子片段与其他蛋白融合，得到具有多样性生物功能的融合蛋白。构建方式：含Fv段的抗体融合蛋白 应用：免疫靶向 免疫桥连 嵌合受体含Fc段的抗体融合蛋白 应用：检测、纯化 延长血清中半寿期 生物学效应功能B双特异性抗体：是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体。特点是：结构双价；功能单价应用：免疫诊断学上的应用；肿瘤放射免疫显像中的应用；双特异抗体介导的药物杀伤效应；双特异抗体介导的细胞杀伤效应第六章 抗体库技术（一个名词解释，一个简答）1、抗体库技术的概念 即用基因克隆技术将全套抗体（Repertoire）重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到表达载体，通过原核或真核直接表达有功能的抗体分子片段，从中筛选特异性的抗体可变区基因和抗体。2、噬菌体抗体库技术的优势1）可实现单抗的小型化2）可实现单抗的多功能化3）简单易行、生产成本低、筛选容量大、可通过发酵生产、大量制备4）可实现抗体的工业化生产3、大容量库的构建抗体库容量多次构建累积，目前报道最大库容在109-1010 （组合感染法，最大库容 6.5X1010）A增加基因的多样性（取决于CDR多样性）B 提高连接和转化效率方法：电穿孔法优化：提高单次连接和转化效率（载体性质、酶切与连接效率、载体与目的基因的比例；感染态细胞的质量、载体与细菌的比例、点击缓冲液的组成等）策略：增加连接和转化次数C 高效的包装和呈现效率超噬菌体系统（Hyperphage）P（分子量小，无空间位阻和干扰效应）辅助噬菌体的选择（如CT型，减少假噬粒）4、噬菌粒的概念、特点概念：噬菌粒(phagemid):是含有丝状噬菌体基因间隔区的质粒载体。特点：A本身不含有噬菌体编码蛋白基因，在宿主中不产生子代噬菌体，但在辅助噬菌体超感染下，可包装成成熟颗粒，并释放、感染新的宿主。B若在phagemid中克隆入抗体基因，可得到噬菌体抗体。C Phagemid在DNA重组操作上比较简单，且所建库容量大。5、噬菌体抗体库构建的主要技术流程、主要特点。1） 基因的获取：（1）从基因文库中获取可变区基因 （2）用PCR法扩增Ig的VH和VL基因2） 载体的构建、连接：3）表达、淘选4）扩增、筛选：抗体库的富集5）鉴定、分析：序列测定（基因测序）；库容的测定（菌斑）；亲和性测定（ELISA）；特异性测定(WB)6、 抗体库技术有哪些方面的应用。在寄生虫学的应用；微生物的研究；在肿瘤诊断和治疗方面的应用；药物设计中的应用；制备各种功能抗体片段第七章 转人Ig基因小鼠1、基因打靶技术：是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法2、转基因动物：指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物3、转人Ig基因小鼠的优点： 1）携带抗体生成需要的全部基因信息（所带的人DNA 片段具有完备的功能，可以自主有效的进行同种型转换和亲和力成熟。）2）建立种系后，通过免疫获得不同的抗体（任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠使其产生高亲和力的人抗体 ）3）精确地重现人抗体的产生过程（能够提供几乎完全相同的人免疫球蛋白基因环境并在鼠体内精确的重现了人抗体的产生过程4、 转基因动物制备主要流程以及关键点。DNA显微注射 电转移ES细胞受精卵血细胞胚胎囊胚原肠胚转基因动物显微注射 逆转录病毒感染DNA DNA制备转人Ig基因小鼠的主要步骤：1） 获得人Ig基因(重链IgH和轻链Ig)：常通过构建人Ig的YAC文库和筛选获得。2） 小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)的分离与培养。3） 制备内源性Ig基因敲除小鼠。4） 获得含完整人Ig-YACs的克隆，并导入小鼠ESCs建立表达人Ig的小鼠胚胎干细胞(Ig-ESCs)。5） 小鼠胚胎的分离和Ig-ESCs向小鼠胚胎的植入，产生含人Ig基因的嵌合小鼠。6） 制备含人Ig基因的纯合小鼠，并通过含人Ig基因的纯合小鼠制备特异的完全人源化抗体。第九章 抗体相关技术(一个名词解释) 1、蛋白质的等电点：蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH