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凝胶电泳常见问题分析请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？参考见解：过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。一个让PAGE胶很快聚合的方法：不 要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中， 这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固 （当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？参考见解：1、 配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面12mm即可。2、 电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。3、 上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。跑出的DNA带模糊？参考见解：1、 DNA降解：避免核酸酶污染。2、 电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。3、 所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。4、 DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。5、 DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。6、 有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。7、 DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。有不规则DNA带迁移?参考见解：1、 对于/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。2、 电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度30；经常更换电泳缓冲液。3、 DNA变性：以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。跑出的DNA条带带弱或无DNA带？参考见解：1、 DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。2、 DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。3、 DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。4、 对于EB染色的DNA，所用光源不合适?应用短波长（254nm）的紫外光源。跑出的DNA带缺失不完整是怎么回事?参考见解：?1、 小DNA带走出凝胶?缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。2、 分子大小相近的DNA带不易分辨?增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。3、 DNA 变性：电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA。DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适?在脉冲凝胶电泳上分析。做PCR电泳后跑电泳，目的基因是489BP的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？为什么？参 考见解：有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去 了，后来证实片段没有问题。也有做的一个片段也是这样，是490BP.理论上两个条带一样，可是PCR结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又 全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。跑完PCR，暂时不方便胶回收，条带已经切下来放到ep管里了，这个能保存么？会不会有不良影响？参考见解：还有个问题，pcr的产物可以不可以直接拿来做模板再进行pcr。我试过，可是总是出现一个拖尾亮条，没有带，是什么原因呢？割下来的胶放在-20保存两个星期完全没有问题。切下来的胶放在4度冰箱中4、5小时没有问题回收的效果也很好。凝胶回收DNA实验的关键在哪里?参 考见解：最关键的是切胶之后,溶胶的那一步.切胶的时候要尽量把多余的琼脂糖凝胶切干净,按照实验步骤,第一步应该是将胶充分的溶化.这以后步一定要做充 分,保证凝胶已经完全溶解了.加乙醇这步也很关键，当凝胶溶解后最好多过几次柱子。还有就是洗脱的那一步。洗脱的时候最好用加热到60度 的洗脱液洗脱，如果实在效果不好可以分两次洗脱。切胶的时候如何能切的准呢？条带的位置肉眼很难判断出来，如何判断条带的位置呢？参 考见解：可以将产物与Marker一起电泳，染色后，在紫外灯下观察结果，跟Marker进行相比，就知道要的是哪条带。注意，紫外灯下切胶速度要快，否 则DNA会降解，另外，紫外线对身体伤害很大，特别是眼睛，请注意采取保护措施（比如在专门的